1. 概述
PuriMag G-Iminobiotin是2-亞氨基生物素偶聯(lián)的磁性納米顆粒，用于磁性分離抗生物素蛋白、親和素或鏈霉親和素標(biāo)記的組分。磁珠具有大的表面積和高捕獲效率。
關(guān)于親和素-生物素、鏈霉親和素-生物素和單體親和素與生物素相互作用的文獻(xiàn)中有很多。生物素與親和素的結(jié)合非常強(qiáng)，KD約為10-15；據(jù)報道，鏈霉親和素具有相似的 KD 值。然而，亞氨基生物素的解離常數(shù)要低得多，這與pH值有關(guān)。亞氨基生物素的 pKa 在 11-12 的范圍內(nèi)，堿的 KD = 3.5 x 10-11，但在 pH 值 3-4 時，質(zhì)子化亞氨基生物素的 KD <10-3 .
>C=NH : >C= NH2+
high pH low pH
分離親和素-生物素或鏈霉親和素-生物素復(fù)合物的條件極其苛刻，需要使用6M胍鹽和pH 1.5。在這些條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)完全變性，無法回收。親和素和鏈霉親和素在極端 pH 值下是穩(wěn)定的，但與它們偶聯(lián)的蛋白質(zhì)不太穩(wěn)定。使用亞氨基生物素標(biāo)記物或亞氨基生物素磁珠，用乙酸鹽緩沖液將pH值降低至約4通常足以使配體質(zhì)子化，釋放鏈霉親和素標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
2. 產(chǎn)品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Streptavidin group
Group density
~150 μmol iminobiotin / g Beads
Binding capacity
≥30 μg streptavidin / mg Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in 0.5 M NaCl, 0.01 M sodium phosphate, pH 6.8, containing 0.02% sodium azide
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
A. 緩沖液（未提供）
1) 結(jié)合/清洗緩沖液：pH 值為 11 的 50 mM 碳酸銨或硼酸鈉，含 0.5 M NaCl
2) 洗脫緩沖液：50 mM 乙酸銨或乙酸鈉，pH 4.0
B. 分離程序
1. 吸取50 μL（0.5 mg）磁珠，每管加入1mL結(jié)合緩沖液洗滌磁珠。
2. 磁力分離2分鐘或至上清液澄清。
3. 吸棄上清液。加入1 mL結(jié)合緩沖液再洗滌一次。
4. 重復(fù)步驟2.取出并丟棄上清液。
5. 加入450 μL結(jié)合緩沖液重懸磁珠。
6. 將50 μL血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入磁珠中。
注意：樣本量可以根據(jù)用戶偏好進(jìn)行修改。如果樣品上清液體積<500μL，用結(jié)合緩沖液稀釋至終濃度為500μL。
7. 使用旋渦或旋轉(zhuǎn)器輕輕混合30分鐘。
8. 使用磁力分離器磁力分離2分鐘或至上清液澄清。
9. 去除并丟棄上清液。
10. 加入500μL結(jié)合緩沖液洗滌磁珠，并除去未結(jié)合的蛋白。
11. 再次重復(fù)步驟8和9。除去上清液。
12. 將100μL洗脫緩沖液加入磁珠中并充分混合。
13. 在室溫下孵育10分鐘，偶爾溫和攪拌或渦旋。
14. 將洗脫的樣品脫鹽或透析以轉(zhuǎn)移到合適的緩沖液中。
C. 注意事項
通過類比固定化親和素和 2-亞氨基生物素或其偶聯(lián)物的洗脫，使用 0.1% （w/v） Triton X-100、吐溫 80、脫氧膽酸鈉可能不會干擾親和分離。但十二烷基硫酸鈉（SDS）的使用完全破壞了所有的結(jié)合。
辣根過氧化物酶和親和素/鏈霉親和素的堿性磷酸酶偶聯(lián)物也可以通過2-亞氨基生物素磁珠純化。磁珠在pH 10而不是pH 11下平衡，并使用pH 6緩沖液實現(xiàn)特異性洗脫。
在前面提到的類似系統(tǒng)中，使用pH 4.0緩沖液或使用含有1 mM生物素的50 mM Tris-HCl（pH 6.8）實現(xiàn)特異性洗脫。這樣做的優(yōu)點(diǎn)是需要酸性較低的緩沖液，但缺點(diǎn)是生物素選擇性地（基本上是永久地）與親和素磁珠結(jié)合，取代了亞氨基生物素類似物。
亞氨基生物素磁珠可以通過用 pH 11 緩沖液洗滌來再生，然后在 0-8°C 下儲存在 pH 值為 7 的含有 0.5 M NaCl 和合適防腐劑的緩沖液中。
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