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規(guī)格
MS-NTA001
1 ml
MS-NTA010
10 ml
1. 產(chǎn)品描述
MagStart-NTA是一種專有的磁性聚合物微粒載體，用于Ni親和捕獲、純化和回收His標(biāo)簽融合蛋白。MagStart微球技術(shù)的進(jìn)步使生物分子可在整個(gè)微?？臻g滲透和結(jié)合，提供了極高的高官能團(tuán)密度允許His標(biāo)簽的生物分子的多點(diǎn)親和捕獲，從而增強(qiáng)靶蛋白的結(jié)合。這一特性使得在結(jié)合緩沖液中能夠使用較高的咪唑濃度，從而減少雜蛋白的非特異結(jié)合，進(jìn)而提高目標(biāo)蛋白的純度。MagStart-NTA可替代MagReSyn?NTA，非常適合從復(fù)雜的生物混合物（如細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)上清液）中以高效純化6×His標(biāo)記蛋白。MagStart-NTA在蛋白分離前不需樣品澄清（在細(xì)胞破壞后），改進(jìn)了磁珠工作站自動(dòng)純化的應(yīng)用。
先進(jìn)的MagStart聚合物技術(shù)允許微粒進(jìn)行對(duì)高度特異性的工程設(shè)計(jì)，以解決當(dāng)前微粒技術(shù)的局限性。MagStart可快速磁分離（<10 秒），可防止微粒的意外丟棄而避免潛在的代價(jià)高昂的樣品損失，提高了效率和回收率。這些微粒采用多種化學(xué)表面修飾，以提供超高純度的目標(biāo)蛋白，滿足嚴(yán)格的研發(fā)和質(zhì)譜樣品要求。
Product Specifications
Description
Iron oxide-containing magnetic polymer microspheres
Application
Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography (IMAC) of Histidine (His)-tagged proteins
Matrix
Proprietary polymer
Core
Iron (II, III) oxide (Magnetite)
Functional group
Nitrilotriacetic acid (NTA) with chelated nickel (Ni2+)
Binding capacity
≥ 1.0 mg of a His-tagged GFP/ml suspension
Particle Size
~5–10 μm
Formulation
25 mg/ml in 20% ethanol
Stability
pH 3.5~10, 4~60 ℃
Storage
Store at 4–8?C until expiry date on label. DO NOT FREEZE!
注意：不當(dāng)儲(chǔ)存、微粒干燥、細(xì)菌污染或離心回收可能導(dǎo)致容量/性能的不可逆損失。使用前應(yīng)充分混勻。
2. 結(jié)合和洗脫程序
可能影響6×His蛋白的Ni親和純化效率的幾個(gè)因素為緩沖液組成和pH、污染物/干擾化合物的存在、可降解靶蛋白的蛋白酶存在及蛋白上6×His標(biāo)簽的位置（例如N-末端、C-末端或三明治融合標(biāo)簽）。MagStart-NTA在結(jié)合/洗滌和洗脫緩沖液中與8M尿素兼容。如沒(méi)達(dá)到最佳性能，請(qǐng)參閱本指南推薦的結(jié)合/洗滌/洗脫程序及故障排除指南。
注意：所有試劑都應(yīng)新制，并為分析級(jí)，以確保最佳性能。下面描述的程序、方法和緩沖液只是一個(gè)例子，并不旨在進(jìn)行限制。MagStart-NTA與一系列不同的緩沖液兼容，用于結(jié)合/吸附和洗脫/解吸?？蓪?shí)現(xiàn)的純度和產(chǎn)率是配體依賴性的，并且對(duì)于每種純化的配體都應(yīng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。
2.1. MagStart-NTA的平衡
MagStart-NTA以25 mg/ml的20%乙醇懸浮液的形式提供。使用前，需去除運(yùn)輸溶液，并在結(jié)合緩沖液（如80 mM磷酸鈉，pH 7.4–8.0，40 mM咪唑，1.0 M NaCl）中平衡微粒。推薦的方案可以放大或縮小以滿足您的要求-目前的方案估計(jì)可結(jié)合約20μg組氨酸標(biāo)記蛋白。
1） 充分混合徹底懸浮MagStart-NTA磁珠。
2） 將20μl（足以結(jié)合~20μg組氨酸標(biāo)記蛋白）MagStart-NTA轉(zhuǎn)移到新離心管中。
3）磁分離，用移液管吸棄上清。
4） 在200μl結(jié)合緩沖液中洗滌/平衡微粒30 s。
5） 將離心管放在磁分離器上，將磁鐵和離心管倒置兩次，以收集蓋子中殘留的任何微粒。
6） 用移液槍吸除結(jié)合緩沖液，重復(fù)步驟4和5兩次，總共洗滌三次。
7） 從步驟5吸去結(jié)合緩沖液后，MagStart-NTA磁珠準(zhǔn)備好結(jié)合6×His標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
2.2. 蛋白質(zhì)結(jié)合程序
作為標(biāo)準(zhǔn)措施，建議在蛋白質(zhì)純化前，通過(guò)0.2μm過(guò)濾器過(guò)濾或以10000 × g離心5分鐘來(lái)澄清含蛋白質(zhì)的樣品。
1） 將含His標(biāo)記蛋白的樣品添加到2.1準(zhǔn)備好的MagStart-NTA磁珠中。用至少1體積的結(jié)合緩沖液稀釋來(lái)調(diào)節(jié)結(jié)合體積（參見(jiàn)2.1），并充分混勻。
2） 使蛋白質(zhì)樣品在室溫下與磁珠結(jié)合5分鐘，同時(shí)進(jìn)行溫和的間歇混勻。
3） 將離心管放在磁性分離器上，磁分離。
4） 用移液管吸去清液或者隨后用于蛋白質(zhì)定量或電泳（例如確定未結(jié)合的蛋白質(zhì)）。
5） 通過(guò)在200μl結(jié)合緩沖液中重懸洗滌結(jié)合蛋白，洗滌30 s，間歇渦旋。
6）磁分離，如管蓋中有磁珠，將磁性分離器倒置，使液體沖洗以收集磁珠。吸棄洗滌緩沖液。
7） 重復(fù)步驟5–6兩次，總共洗三次。洗滌步驟的上清液可丟棄或合并用于蛋白質(zhì)定量或電泳。
2.3. 蛋白質(zhì)洗脫程序
1） 將20–50μl洗脫緩沖液（80 mM磷酸鈉，pH 7.4–8.0，500 mM NaCl，500 mM-咪唑）加入2.2的磁珠中。通過(guò)移液或渦流充分混合。
2） 使蛋白質(zhì)在室溫下洗脫2分鐘。
3） 將離心管放在磁分離器上，磁分離。用移液管抽吸含有感興趣蛋白質(zhì)的洗脫液至一新離心管。
4） 為了提高其標(biāo)記蛋白的回收率，用額外的20-50μl洗脫緩沖液（總共三種洗脫液）再重復(fù)步驟1-3兩次。合并/匯集三種洗脫液。該蛋白質(zhì)現(xiàn)在已準(zhǔn)備好進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)或分析。
2.4. 咪唑和NaCl對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合和洗脫的影響
有效純化所需最佳咪唑濃度將取決于靶蛋白和組氨酸標(biāo)簽的位置（例如N-末端、C-末端或融合物）。較低的咪唑濃度可用于促進(jìn)回收率/產(chǎn)率，盡管可能以犧牲純度為代價(jià)。MagStart磁珠的配方可在高達(dá)80mM咪唑的存在下結(jié)合6×His標(biāo)記的蛋白質(zhì)，而不會(huì)顯著影響目標(biāo)蛋白的回收或產(chǎn)量（蛋白質(zhì)和標(biāo)簽依賴性）。雖然在結(jié)合/洗滌步驟中增加咪唑濃度可用于提高靶蛋白的純度，但這可能導(dǎo)致產(chǎn)率的降低。對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)，500mM咪唑通常足以洗脫，而其他蛋白質(zhì)可能需要高達(dá)1M咪唑才能有效洗脫。在進(jìn)行高咪唑洗脫前，一定要檢查蛋白質(zhì)功能與這些條件的兼容性。NaCl的濃度可增加到2M以減少非特異性離子相互作用，從而潛在地增加標(biāo)記蛋白的純度。建議在磁珠中加入過(guò)量的His標(biāo)記蛋白，因?yàn)檫@可能有助于最大限度地減少非特異性相互作用，最大限度提高目標(biāo)蛋白純度。
3. 兼容性
目前方案已成功用于從含有以下任一成分的磷酸鹽緩沖鹽水 （PBS） 或 Tris 50mM pH 8.0 中提取的哺乳動(dòng)物細(xì)胞裂解物中純化蛋白質(zhì)：
? Urea≤8 M ? Triton? X-100≤5%
? Tween? 20≤1% ? NaCl ≤2 M ? Glycerol≤50%
Tris, MOPS, Sodium/Potassium phosphate≤100 mM
4. 常見(jiàn)問(wèn)題
問(wèn)題
可能原因
改善方法
蛋白質(zhì)不會(huì)像預(yù)期的那樣與微粒結(jié)合
不正確的結(jié)合pH
將結(jié)合緩沖液的pH至少提高到7.4
感興趣的蛋白質(zhì)降解
向粗蛋白質(zhì)提取物中添加蛋白酶抑制劑
樣品中干擾化合物阻止結(jié)合
將樣品脫鹽或透析到推薦結(jié)合緩沖液，以去除介質(zhì)成分或干擾污染物
顆粒數(shù)量不足
增加磁珠的數(shù)量
蛋白含量過(guò)低
增加蛋白濃度或起始樣品量來(lái)增加蛋白含量
蛋白序列不對(duì)
通過(guò)測(cè)序確認(rèn)克隆
洗脫過(guò)程中蛋白質(zhì)回收率低
親和結(jié)合很強(qiáng)
提高洗脫液咪唑濃度
蛋白可能有金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域
增加咪唑濃度或用酸性液洗脫，如pH為3–4
蛋白質(zhì)在純化過(guò)程中發(fā)生降解
向樣品和緩沖液中添加蛋白酶抑制劑，以防蛋白水解。使用新制樣品和溶液，盡可能減少樣品制備時(shí)間，在4?C
蛋白在洗脫液中可能不穩(wěn)定或無(wú)活性
確定感興趣蛋白最佳pH和鹽穩(wěn)定性，并相應(yīng)地調(diào)整方案
洗脫蛋白純度不足（共洗脫污染蛋白）
洗滌效率低
增加洗滌次數(shù)和體積及洗滌液NaCl濃度（最高2M）。將洗滌液中咪唑濃度提高至80mM
靶蛋白的特異性降解
緩沖液中添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白水解
靶蛋白不完全
使用的微粒數(shù)量不足
增加用于純化的MagStart-NTA的數(shù)量
洗脫后靶蛋白無(wú)活性
咪唑或緩沖鹽的干擾
通過(guò)透析、過(guò)濾、沉淀或排阻色譜去除咪唑或緩沖鹽。降低咪唑濃度以進(jìn)行洗脫或在酸性緩沖液中洗脫，例如pH為3-4的檸檬酸鹽；用合適堿性緩沖液洗脫后立即降低pH。
不兼容下游應(yīng)用
咪唑、緩沖劑或鹽的干擾
通過(guò)透析、過(guò)濾、沉淀或排阻色譜去除咪唑。
參考文獻(xiàn)：
1. Acosta J, Nguyen K, Spitale R C, et al. Taylor-made production of pyrimidine nucleoside-5′-monophosphate analogues by highly stabilized mutant uracil phosphoribosyltransferase from Toxoplasma gondii[J]. Bioresource Technology, 2021, 339: 125649.
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