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Name
Cat. No.
Vol.
Scheme
G-ProA
PMG013-2
2 ml
G-ProG
PMG014-2
G-ProA/G
PMG029-2
G-ProL
PMG030-2
1. 概述
PuriMag? Beads通過親和作用提供了一種快速方便地磁分離抗體的方法。共價連接到封閉磁珠表面的重組蛋白A、蛋白G、蛋白L可以結(jié)合來自許多不同物種的抗體，使得能夠從粗提取物中純化抗體。用蛋白A、蛋白G、蛋白L包被的磁珠進(jìn)行的免疫沉淀測定，背景低，靶抗原的產(chǎn)率高。使用交聯(lián)劑化學(xué)，您可以將抗體固定在磁性顆粒上，并防止IP或Co-IP實驗中的IgG污染。蛋白A、蛋白G、蛋白L磁珠通常用于從血清，細(xì)胞培養(yǎng)上清液或腹水中分離抗體，并用于免疫沉淀和細(xì)胞或組織提取物中抗原的免疫共沉淀。與阻斷的磁珠表面共價連接的重組蛋白L通過κ輕鏈選擇性結(jié)合小鼠和人抗體。由于蛋白L不結(jié)合牛IgG，珠通常用于純化補充有牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的單克隆抗體。為了純化抗體，將磁珠與抗體溶液一起溫育，然后從上清液中磁分離。為了進(jìn)行免疫沉淀，將珠子加入到已加入抗體的含抗原樣品中并允許孵育以形成抗體 - 抗原復(fù)合物。使用洗脫緩沖液將結(jié)合的抗體或抗原從珠上解離。用磁力架或自動化儀器將目標(biāo)純化物溶液從移出。
PuriMag? G-ProA磁珠含有每個蛋白質(zhì)具有5個Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組蛋白A（分子量44.7kDa，通過SDS-PAGE約47kDa的表觀分子量）。這些結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合來自許多不同物種的抗體，包括小鼠、人、兔、豬、狗和貓。當(dāng)使用復(fù)雜的生物樣品時，磁珠上專有的封閉劑可最大限度地減少或消除磁珠表面的非特異性結(jié)合。
PuriMag G-ProG磁珠含有每個蛋白具有2個Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組蛋白G（分子量21.6kDa;通過SDS-PAGE約32kDa的表觀分子量）。這些結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合來自許多不同物種的抗體，包括小鼠，人，兔，牛，山羊和綿羊。已經(jīng)從重組蛋白G中消除了白蛋白和細(xì)胞表面結(jié)合結(jié)構(gòu)域以減少非特異性結(jié)合。另外，當(dāng)使用復(fù)雜的生物樣品時，磁珠上專有的封閉劑可以最小化或消除珠粒表面上的非特異性結(jié)合。為獲得最佳結(jié)果提供了詳細(xì)說明和優(yōu)化的緩沖區(qū)組件。
PuriMag? G-ProA/G是PuriMag? G-ProA和PuriMag? G-ProG按1:1混合所得，兼有兩者的性質(zhì)。
PuriMag G-ProL磁珠含有重組蛋白L（分子量35.8kDa，通過SDS-PAGE約36kDa的表觀分子量），每個蛋白質(zhì)具有4個免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域可通過κ輕鏈與蛋白A或蛋白G（包括IgG，IgM，IgA，IgE和IgD）結(jié)合至更寬范圍的Ig類別。蛋白L還結(jié)合單鏈可變片段（scFv）和含有κ輕鏈的Fab片段。當(dāng)使用復(fù)雜的生物樣品時，磁珠上專有的封閉劑可最大限度地減少或消除珠粒表面上的非特異性結(jié)合。
PuriMag G-Pro的特點:
l 高效率 – 與其它供應(yīng)商的磁珠相當(dāng)或更高的IP 靶抗原產(chǎn)量；
l 非特異性結(jié)合 – 穩(wěn)定的預(yù)封閉磁珠可提供高度純化的產(chǎn)物（例如，用抗體在 IP 中洗脫的抗原不含來自復(fù)雜細(xì)胞裂解物的污染蛋白）；
l 一致性 – 磁珠可消除樹脂損失，與僅使用離心的傳統(tǒng) IP 方法相比，可實現(xiàn)更有效的分離；
l 用途廣泛 – 多功能珠兼容手動和自動化工作流程。
2. 產(chǎn)品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
ProA, ProG, ProL group
Binding capacity
>60 μg rabit IgG / mg Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in DI water, 0.05% NaN3，0.01% Tween 20，0.05% BSA
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
3.1 注意事項
? 請勿離心、干燥或冷凍 PuriMag G-ProA 珠子。離心、干燥或冷凍會導(dǎo)致微珠聚集并失去結(jié)合活性。為確保磁珠的良好分散以實現(xiàn)最佳抗體結(jié)合，重要的是在結(jié)合緩沖液中加入 0.025% 至 0.1% 的非離子（例如吐溫-20 去污劑）或兩性離子（例如 CHAPS）去污劑，并在孵育過程中混合磁珠。
? 為了最大限度地減少蛋白質(zhì)降解，在制備細(xì)胞裂解物時加入蛋白酶抑制劑。
? 低pH洗脫可用于一次性應(yīng)用。低pH洗脫的最佳時間為10分鐘;超過 10 分鐘可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合和產(chǎn)量降低。
? 在下游蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用中使用兔抗體（一抗或二抗）時，在室溫下在SDS-PAGE樣品緩沖液中進(jìn)行洗脫。對于所有其他抗體種類，在SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸微珠對于一次性應(yīng)用是可以接受的。
注意：煮沸磁珠會導(dǎo)致磁珠聚集和失去結(jié)合活性。
? PuriMag G-ProA 微球與小規(guī)?？贵w純化和免疫沉淀以及蛋白質(zhì)印跡分析兼容。
? 在從不同來源血清中分離多克隆 IgG 時，請選擇合適的蛋白磁珠。
3.2 純化抗體流程
A. 緩沖液
? Binding/Wash Buffer: Tris-buffered saline (50 mM Tris, 150 mM NaCl,Adjust pH with HCl to pH 7.6) containing 0.05% Tween-20
? Elution Buffer: IgG elution buffer or 0.1M glycine, pH 2.0
? Neutralization Buffer: High-ionic strength alkaline buffer such as a 1M phosphate or 1M Tris; pH 7.5-9
B. 純化抗體（from Serum, Cell Culture Supernatant or Ascites）
注意：為確保均勻性，請在使用前通過反復(fù)倒置、輕輕渦旋或使用旋轉(zhuǎn)平臺徹底混合珠子。
1. 將 50μL （0.50mg） PuriMag G-ProA 微珠放入 1.5mL 微量離心管中。向珠子中加入 150μL 結(jié)合/洗滌緩沖液，輕輕渦旋混合。
2. 將試管放入磁性支架中，將珠子收集在試管側(cè)面。取出并丟棄上清液。
3. 向試管中加入 1mL 結(jié)合/洗滌緩沖液。將試管倒置數(shù)次或輕輕渦旋混合 1 分鐘。用磁架收集珠子，然后取出并丟棄上清液。
4. 用 490μL 結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋 10μL 樣品。
注意：樣品體積可根據(jù)用戶喜好進(jìn)行修改。如果樣品體積< 500μL，則用結(jié)合/洗滌緩沖液將其稀釋至最終體積 500μL。
5.將稀釋后的樣品加入裝有預(yù)洗磁珠的試管中，輕輕渦旋或倒置混合。
6. 將樣品在室溫下孵育，混合 1 小時。
7.用磁性支架收集珠子，然后取出并棄去上清液。
8. 向試管中加入 500μL 結(jié)合/洗滌緩沖液，充分混合，用磁架收集珠子并棄去上清液。重復(fù)此洗滌兩次。
9. 向試管中加入 100μL 洗脫緩沖液，充分混合并在室溫下孵育 10 分鐘，偶爾混合。
10.用磁架收集磁珠，然后保存含有洗脫抗體的上清液。要中和低pH值，每100μL洗脫液加入15μL中和緩沖液。
注意：推薦用于抗體純化的磁珠最小體積為 50μL。
3.3 免疫共沉淀流程
? Binding Buffer: Buffer used to prepare antigen sample
? Wash Buffer: Tris-buffered saline (50 mM Tris, 150 mM NaCl, adjust pH with HCl to pH 7.6) containing 0.05% Tween-20
? Neutralization Buffer: 1M Tris, pH 8.5
B. 免疫沉淀
注意：本實驗方案是免疫沉淀的一般指南，每種應(yīng)用都需要進(jìn)行優(yōu)化。
1. 將抗原樣本與 5 - 10μg 的抗體混合。用細(xì)胞裂解緩沖液將反應(yīng)體積調(diào)整至 500μL。在室溫下混合孵育反應(yīng) 1 - 2 小時，或在 4℃下過夜孵育。
2. 將 25μL（0.25mg）的 Pierce 蛋白 A 磁珠放入 1.5mL 微量離心管中。
3. 向磁珠中加入 175μL 洗滌緩沖液，輕輕渦旋混合。
4. 將離心管放入磁力架中，使磁珠聚集在管的一側(cè)。移除并丟棄上清液。
5. 向管中加入 1mL 洗滌緩沖液。將管顛倒幾次或輕輕渦旋混合 1 分鐘。用磁力架收集磁珠。移除并丟棄上清液。
6. 將抗原樣本 / 抗體混合物加入含有預(yù)洗磁珠的 1.5mL 微量離心管中，并在室溫下混合孵育 1 小時。
7. 用磁力架收集磁珠，然后移除流出液并保存用于分析。
8. 向管中加入 500μL 洗滌緩沖液并輕輕混合。收集磁珠并丟棄上清液。重復(fù)洗滌兩次。
9. 向管中加入 500μL 超純水并輕輕混合。用磁力架收集磁珠并丟棄上清液。
磁珠客戶發(fā)表的相關(guān)論文：
1. Chen Xiao-Li, et al. Direct Blood Culturing of Candida spp. on Solid Medium by a Rapid Enrichment Method with Magnetic Beads Coated with Recombinant Human Mannan-Binding Lectin, Journal of Clinical Microbiology, Volume 58, Issue 4, 2020, DOI: https://doi.org/10.1128/jcm.00057-20 （Homo-strep和蛋白A磁珠偶聯(lián)抗體）
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