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Name
Cat. No.
Vol.
Scheme
G-ProA
PMG013-2
2 ml
G-ProG
PMG014-2
G-ProA/G
PMG029-2
G-ProL
PMG030-2
1. 概述
PuriMag? Beads通過(guò)親和作用提供了一種快速方便地磁分離抗體的方法。共價(jià)連接到封閉磁珠表面的重組蛋白A、蛋白G、蛋白L可以結(jié)合來(lái)自許多不同物種的抗體，使得能夠從粗提取物中純化抗體。用蛋白A、蛋白G、蛋白L包被的磁珠進(jìn)行的免疫沉淀測(cè)定，背景低，靶抗原的產(chǎn)率高。使用交聯(lián)劑化學(xué)，您可以將抗體固定在磁性顆粒上，并防止IP或Co-IP實(shí)驗(yàn)中的IgG污染。蛋白A、蛋白G、蛋白L磁珠通常用于從血清，細(xì)胞培養(yǎng)上清液或腹水中分離抗體，并用于免疫沉淀和細(xì)胞或組織提取物中抗原的免疫共沉淀。與阻斷的磁珠表面共價(jià)連接的重組蛋白L通過(guò)κ輕鏈選擇性結(jié)合小鼠和人抗體。由于蛋白L不結(jié)合牛IgG，珠通常用于純化補(bǔ)充有牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的單克隆抗體。為了純化抗體，將磁珠與抗體溶液一起溫育，然后從上清液中磁分離。為了進(jìn)行免疫沉淀，將珠子加入到已加入抗體的含抗原樣品中并允許孵育以形成抗體 - 抗原復(fù)合物。使用洗脫緩沖液將結(jié)合的抗體或抗原從珠上解離。用磁力架或自動(dòng)化儀器將目標(biāo)純化物溶液從移出。
PuriMag? G-ProA磁珠含有每個(gè)蛋白質(zhì)具有5個(gè)Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組蛋白A（分子量44.7kDa，通過(guò)SDS-PAGE約47kDa的表觀分子量）。這些結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合來(lái)自許多不同物種的抗體，包括小鼠、人、兔、豬、狗和貓。當(dāng)使用復(fù)雜的生物樣品時(shí)，磁珠上專(zhuān)有的封閉劑可最大限度地減少或消除磁珠表面的非特異性結(jié)合。
PuriMag G-ProG磁珠含有每個(gè)蛋白具有2個(gè)Fc結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組蛋白G（分子量21.6kDa;通過(guò)SDS-PAGE約32kDa的表觀分子量）。這些結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合來(lái)自許多不同物種的抗體，包括小鼠，人，兔，牛，山羊和綿羊。已經(jīng)從重組蛋白G中消除了白蛋白和細(xì)胞表面結(jié)合結(jié)構(gòu)域以減少非特異性結(jié)合。另外，當(dāng)使用復(fù)雜的生物樣品時(shí)，磁珠上專(zhuān)有的封閉劑可以最小化或消除珠粒表面上的非特異性結(jié)合。為獲得最佳結(jié)果提供了詳細(xì)說(shuō)明和優(yōu)化的緩沖區(qū)組件。
PuriMag? G-ProA/G是PuriMag? G-ProA和PuriMag? G-ProG按1:1混合所得，兼有兩者的性質(zhì)。
PuriMag G-ProL磁珠含有重組蛋白L（分子量35.8kDa，通過(guò)SDS-PAGE約36kDa的表觀分子量），每個(gè)蛋白質(zhì)具有4個(gè)免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域可通過(guò)κ輕鏈與蛋白A或蛋白G（包括IgG，IgM，IgA，IgE和IgD）結(jié)合至更寬范圍的Ig類(lèi)別。蛋白L還結(jié)合單鏈可變片段（scFv）和含有κ輕鏈的Fab片段。當(dāng)使用復(fù)雜的生物樣品時(shí)，磁珠上專(zhuān)有的封閉劑可最大限度地減少或消除珠粒表面上的非特異性結(jié)合。
PuriMag G-Pro的特點(diǎn):
l 高效率 – 與其它供應(yīng)商的磁珠相當(dāng)或更高的IP 靶抗原產(chǎn)量；
l 非特異性結(jié)合 – 穩(wěn)定的預(yù)封閉磁珠可提供高度純化的產(chǎn)物（例如，用抗體在 IP 中洗脫的抗原不含來(lái)自復(fù)雜細(xì)胞裂解物的污染蛋白）；
l 一致性 – 磁珠可消除樹(shù)脂損失，與僅使用離心的傳統(tǒng) IP 方法相比，可實(shí)現(xiàn)更有效的分離；
l 用途廣泛 – 多功能珠兼容手動(dòng)和自動(dòng)化工作流程。
2. 產(chǎn)品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
ProA, ProG, ProL group
Binding capacity
>60 μg rabit IgG / mg Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in DI water, 0.05% NaN3，0.01% Tween 20，0.05% BSA
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
3.1 注意事項(xiàng)
? 請(qǐng)勿離心、干燥或冷凍 PuriMag G-ProA 珠子。離心、干燥或冷凍會(huì)導(dǎo)致微珠聚集并失去結(jié)合活性。為確保磁珠的良好分散以實(shí)現(xiàn)最佳抗體結(jié)合，重要的是在結(jié)合緩沖液中加入 0.025% 至 0.1% 的非離子（例如吐溫-20 去污劑）或兩性離子（例如 CHAPS）去污劑，并在孵育過(guò)程中混合磁珠。
? 為了最大限度地減少蛋白質(zhì)降解，在制備細(xì)胞裂解物時(shí)加入蛋白酶抑制劑。
? 低pH洗脫可用于一次性應(yīng)用。低pH洗脫的最佳時(shí)間為10分鐘;超過(guò) 10 分鐘可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合和產(chǎn)量降低。
? 在下游蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用中使用兔抗體（一抗或二抗）時(shí)，在室溫下在SDS-PAGE樣品緩沖液中進(jìn)行洗脫。對(duì)于所有其他抗體種類(lèi)，在SDS-PAGE樣品緩沖液中煮沸微珠對(duì)于一次性應(yīng)用是可以接受的。
注意：煮沸磁珠會(huì)導(dǎo)致磁珠聚集和失去結(jié)合活性。
? PuriMag G-ProA 微球與小規(guī)?？贵w純化和免疫沉淀以及蛋白質(zhì)印跡分析兼容。
? 在從不同來(lái)源血清中分離多克隆 IgG 時(shí)，請(qǐng)選擇合適的蛋白磁珠。
3.2 純化抗體流程
A. 緩沖液
? Binding/Wash Buffer: Tris-buffered saline (50 mM Tris, 150 mM NaCl,Adjust pH with HCl to pH 7.6) containing 0.05% Tween-20
? Elution Buffer: IgG elution buffer or 0.1M glycine, pH 2.0
? Neutralization Buffer: High-ionic strength alkaline buffer such as a 1M phosphate or 1M Tris; pH 7.5-9
B. 純化抗體（from Serum, Cell Culture Supernatant or Ascites）
注意：為確保均勻性，請(qǐng)?jiān)谑褂们巴ㄟ^(guò)反復(fù)倒置、輕輕渦旋或使用旋轉(zhuǎn)平臺(tái)徹底混合珠子。
1. 將 50μL （0.50mg） PuriMag G-ProA 微珠放入 1.5mL 微量離心管中。向珠子中加入 150μL 結(jié)合/洗滌緩沖液，輕輕渦旋混合。
2. 將試管放入磁性支架中，將珠子收集在試管側(cè)面。取出并丟棄上清液。
3. 向試管中加入 1mL 結(jié)合/洗滌緩沖液。將試管倒置數(shù)次或輕輕渦旋混合 1 分鐘。用磁架收集珠子，然后取出并丟棄上清液。
4. 用 490μL 結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋 10μL 樣品。
注意：樣品體積可根據(jù)用戶(hù)喜好進(jìn)行修改。如果樣品體積< 500μL，則用結(jié)合/洗滌緩沖液將其稀釋至最終體積 500μL。
5.將稀釋后的樣品加入裝有預(yù)洗磁珠的試管中，輕輕渦旋或倒置混合。
6. 將樣品在室溫下孵育，混合 1 小時(shí)。
7.用磁性支架收集珠子，然后取出并棄去上清液。
8. 向試管中加入 500μL 結(jié)合/洗滌緩沖液，充分混合，用磁架收集珠子并棄去上清液。重復(fù)此洗滌兩次。
9. 向試管中加入 100μL 洗脫緩沖液，充分混合并在室溫下孵育 10 分鐘，偶爾混合。
10.用磁架收集磁珠，然后保存含有洗脫抗體的上清液。要中和低pH值，每100μL洗脫液加入15μL中和緩沖液。
注意：推薦用于抗體純化的磁珠最小體積為 50μL。
3.3 免疫共沉淀流程
? Binding Buffer: Buffer used to prepare antigen sample
? Wash Buffer: Tris-buffered saline (50 mM Tris, 150 mM NaCl, adjust pH with HCl to pH 7.6) containing 0.05% Tween-20
? Neutralization Buffer: 1M Tris, pH 8.5
B. 免疫沉淀
注意：本實(shí)驗(yàn)方案是免疫沉淀的一般指南，每種應(yīng)用都需要進(jìn)行優(yōu)化。
1. 將抗原樣本與 5 - 10μg 的抗體混合。用細(xì)胞裂解緩沖液將反應(yīng)體積調(diào)整至 500μL。在室溫下混合孵育反應(yīng) 1 - 2 小時(shí)，或在 4℃下過(guò)夜孵育。
2. 將 25μL（0.25mg）的 Pierce 蛋白 A 磁珠放入 1.5mL 微量離心管中。
3. 向磁珠中加入 175μL 洗滌緩沖液，輕輕渦旋混合。
4. 將離心管放入磁力架中，使磁珠聚集在管的一側(cè)。移除并丟棄上清液。
5. 向管中加入 1mL 洗滌緩沖液。將管顛倒幾次或輕輕渦旋混合 1 分鐘。用磁力架收集磁珠。移除并丟棄上清液。
6. 將抗原樣本 / 抗體混合物加入含有預(yù)洗磁珠的 1.5mL 微量離心管中，并在室溫下混合孵育 1 小時(shí)。
7. 用磁力架收集磁珠，然后移除流出液并保存用于分析。
8. 向管中加入 500μL 洗滌緩沖液并輕輕混合。收集磁珠并丟棄上清液。重復(fù)洗滌兩次。
9. 向管中加入 500μL 超純水并輕輕混合。用磁力架收集磁珠并丟棄上清液。
磁珠客戶(hù)發(fā)表的相關(guān)論文：
1. Chen Xiao-Li, et al. Direct Blood Culturing of Candida spp. on Solid Medium by a Rapid Enrichment Method with Magnetic Beads Coated with Recombinant Human Mannan-Binding Lectin, Journal of Clinical Microbiology, Volume 58, Issue 4, 2020, DOI: https://doi.org/10.1128/jcm.00057-20 （Homo-strep和蛋白A磁珠偶聯(lián)抗體）
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