1. 概述
PuriMagTM G-Hydrazide酰肼活化磁性納米微粒是均一的、聚合物包覆的超順磁納米粒，親水表面確保磁珠在各種緩沖液中具有出色的分散性、低非特異吸附和易操作性，表面涂有高密度的酰肼官能團(tuán)官能團(tuán)。它通過形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，廣泛用于定點(diǎn)固定含醛或酮的配體，例如抗體、凝集素、糖蛋白和碳水化合物。 PuriMagTM G-Hydrazide酰肼磁珠可用于通過氧化糖基團(tuán)獲得醛基從而固定糖蛋白。它是固定多克隆抗體的理想選擇，多克隆抗體包含位于分子Fc部分的大量碳水化合物。由于此類抗體僅通過Fc部分與磁珠偶聯(lián)，因此它們的抗原結(jié)合位點(diǎn)不受阻礙，可以正確定向，從而提供了更高的純化能力。如果某些單克隆抗體包含足夠量的碳水化合物，則可以使用酰肼磁珠固定化。
固定化化學(xué)使高碘酸鈉氧化多糖部分糖基中的順式乙二醇基團(tuán)。然后，生成的醛與磁珠上的酰肼基自發(fā)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。偶聯(lián)條件在時(shí)間和溫度方面是靈活的。長(zhǎng)的間隔臂減少了空間位阻，并且支持物具有最小的非特異性結(jié)合特性，這使其成為用于親和色譜的極佳磁珠。
特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：
w 共價(jià)高效配對(duì)；
w 穩(wěn)定的共價(jià)鍵和低水平的配體泄漏；
w 產(chǎn)生可重復(fù)使用的免疫親和基質(zhì)；
w 低特異性結(jié)合；
w 固定1~20 mg蛋白質(zhì)或0.1~2mg肽/ 磁珠；
磁珠偶聯(lián)基本原理：
2. 產(chǎn)品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Hydrazide groups
Group density
~300 μmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in in 1M NaCl and 0.02% NaN3
Stability
pH 3.5~10, 4~50 ℃, most organic solvents
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
注意：以下方案是將蛋白或多肽與PuriMagTM G-Hydrazide酰肼磁珠偶聯(lián)的示例。強(qiáng)烈建議進(jìn)行滴定，以優(yōu)化用于每種單獨(dú)應(yīng)用的磁珠量。該協(xié)議可相應(yīng)地按比例放大和縮小。應(yīng)避免使用含有伯胺或糖的Tris或其他緩沖液，因?yàn)樗鼈儠?huì)與預(yù)期的偶聯(lián)反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)。
A. 所需材料
1）磁力架（用于手動(dòng)操作）：用于容納12個(gè)單獨(dú)的1.5~2ml離心管（Mrack02）；用于容納2個(gè)50 ml離心管或2個(gè)15 ml離心管（目錄號(hào)Mrack03）
2）偶聯(lián)緩沖液：0.1 M sodium phosphate, pH 7.0 or 0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.6
3) 氧化試劑： Sodium meta-Periodate (NaIO4)
4）Sephadex G-25 column
5）洗滌緩沖液：1M NaCl
B. 蛋白偶聯(lián)
B-1. 糖蛋白的氧化
注意：該反應(yīng)對(duì)光敏感，應(yīng)在黑暗中進(jìn)行。
1）在1 ml偶聯(lián)緩沖液中溶解或稀釋0.5~10 mg糖蛋白。 （注意：如果蛋白質(zhì)已經(jīng)懸浮在其他緩沖液中，請(qǐng)通過透析脫鹽柱進(jìn)行緩沖液交換。
2）將蛋白質(zhì)溶液添加到含有2 mg偏高碘酸鈉（最終濃度為10 mM）的琥珀色小瓶中。輕輕旋轉(zhuǎn)以溶解氧化劑。）
3）輕輕旋轉(zhuǎn)，在室溫下于黑暗中孵育樣品30分鐘。
4）終止反應(yīng)，并通過Sephadex G25色譜柱進(jìn)行脫鹽和緩沖液交換，除去未反應(yīng)的NaIO4。平衡5毫升。具有偶聯(lián)緩沖液的Sephadex G-25色譜柱。將氧化后的樣品上樣至色譜柱，使其進(jìn)入凝膠床。應(yīng)用0.5 ml的偶聯(lián)緩沖液沖洗，并使其也進(jìn)入凝膠床。最后加入2 ml偶聯(lián)緩沖液并收集洗脫液。
B-2. 以酰肼為末端的磁珠的偶聯(lián)
注意：稱重，用1mM EDTA（濃度：30 mg / ml）懸浮PuriMagTM磁珠，劇烈渦旋分散磁珠并在4°C儲(chǔ)存。使用前先搖晃瓶子以完全重懸磁珠。
1）將完全懸浮的0.5 ml磁珠（30 mg / ml）轉(zhuǎn)移到微量離心管中。
2）將離心管插入磁力分離器中1-3分鐘，直到上清液澄清。當(dāng)試管保留在分離器中時(shí)，用移液管吸出并丟棄上清液。從分離器中取出試管，并用1.5 ml偶聯(lián)緩沖液重懸磁珠
3）重復(fù)步驟2~3次。
4）從分離器中取出離心管，并用750 μl偶聯(lián)緩沖液重懸PuriMagTM磁珠。
5）將磁珠與250 μl氧化蛋白溶液混合，并在室溫下孵育至少6小時(shí)。
注意：偶聯(lián)效率取決于目標(biāo)糖蛋白的結(jié)構(gòu)和大小。使用者應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)優(yōu)化蛋白濃度。對(duì)于10 mg磁珠，我們建議從100~250 μg/ml開始。
6）用1 ml洗滌緩沖液洗滌磁珠3次。
7）用1 ml所需的存儲(chǔ)緩沖液洗滌磁珠3次。
8）用0.1％疊氮化物（w / v）將珠子重懸于PBS緩沖液中至所需濃度，并保存在4°C直至使用。不要凍結(jié)。
C. 一般親和純化方案
注意：設(shè)計(jì)通用的純化DNA或RNA的方案相對(duì)簡(jiǎn)單，因?yàn)楹怂岬纳匦韵鄬?duì)一致。但是，設(shè)計(jì)一種通用的親和純化方案非常困難，因?yàn)槊糠N蛋白質(zhì)都有不同的組成和結(jié)構(gòu)。為了獲得最佳結(jié)果，每個(gè)用戶都必須為各個(gè)應(yīng)用程序確定最佳工作條件。
1）將最適量的PuriMagTM磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中。磁分離1~3分鐘，除去上清液。
注意：強(qiáng)烈建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白的量進(jìn)行滴定，以優(yōu)化用于每種應(yīng)用的磁珠的量。所用磁珠過多會(huì)導(dǎo)致較高背景，而所用磁珠太少則會(huì)導(dǎo)致較低產(chǎn)量。每mg的磁珠通常結(jié)合1~20 ug的目標(biāo)蛋白。
2）取下離心管，用5倍磁珠體積的PBS緩沖液懸浮30秒。磁分離1~3分鐘，除去上清。
3）重復(fù)步驟2兩次
4）將洗滌過的磁珠加入含有目標(biāo)蛋白的粗樣品中，并在室溫或所需溫度下孵育1~2小時(shí)（較低的溫度需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間）。
5）用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl充分洗滌磁珠，直到280 nm洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280 <0.05）。
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