1. 概述
PuriMagTM G-DADPA活化的磁性納米粒子是均勻的，基于親水聚合物包覆的超順磁珠，表面涂有高密度的DADPA（二氨基二丙胺，Diaminodipropylamine）官能團。 類固醇、染料、藥物等是一類小分子，由于缺乏或難以獲得易反應(yīng)的伯胺、巰基、羰基和其它常見偶聯(lián)基團，因此難以或不可能通過當(dāng)前的固定方法固定。 但是，這些小分子可能會通過在曼尼希反應(yīng)（Mannich reaction）中與甲醛和胺縮合的活性氫而被固定在DADPA封端的磁珠上。PuriMagTM G-DADPA磁珠可固定化具有活性氫的類固醇、藥物和化學(xué)化合物，以用于親和純化。
特點與優(yōu)勢：
w 高結(jié)合能力；
w 快速、高效的偶聯(lián)；
w 親水性長臂間隔子，可將空間位阻和非特異性結(jié)合降至最低。
偶聯(lián)反應(yīng)方程：
能發(fā)生Mannich Reaction的常見活潑氫類型：
2. 產(chǎn)品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
DADPA group
Group density
~300 μmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10 mg/ml suspension in 50% acetone
Stability
pH 3.5~10, 4~80 ℃, most organic solvents
Storage
1 year at 4~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
注意：以下方案是將含胺配體與PuriMagTM G-DADPA封端的磁珠偶聯(lián)的示例。強烈建議進行滴定，以優(yōu)化用于每種單獨應(yīng)用的磁珠量。該協(xié)議可相應(yīng)地按比例放大和縮小。
偶聯(lián)緩沖液或配體不應(yīng)包含任何氨基（例如Tris）或甲酰基。由于溶液相聚合，含氨基配體的偶聯(lián)效率非常低。
A. 所需材料
1）磁力架（用于手動操作）：用于容納12個單獨的1.5~2ml離心管（Mrack02）；用于容納2個50 ml離心管或2個15 ml離心管（目錄號Mrack03）
2）偶聯(lián)緩沖液：0.1 M MES，0.15 M NaCl，pH 4.7
3）洗滌緩沖液：0.1 M Tris，pH 8.0
4）偶聯(lián)試劑: 37% formaldehyde
B. 偶聯(lián)方法
B-1.樣品制備
如果可溶，將1-10mg配體溶于1ml偶聯(lián)緩沖液中。如果不溶，則將其溶于0.5 ml 100％乙醇中，然后添加0.5 ml偶聯(lián)緩沖液制成50％乙醇/緩沖液。 （注意：如果使用乙醇進行偶聯(lián)，則在添加樣品之前必須用50％乙醇洗滌磁珠。）
B-2. PuriMagTM磁珠的制備
注意：將PuriMagTM磁珠按10 mg/ml懸浮在20％乙醇水中，劇烈渦旋分散磁珠并儲存在4 ℃。使用前混勻PuriMagTM磁珠。
1) 將10mg磁珠轉(zhuǎn)移至EP管中。
2) 將EP管置于磁磁力架上1min，吸棄上清液，用1ml偶聯(lián)緩沖液重新懸浮磁珠。
3) 重復(fù)步驟2三次。
B-3. 偶聯(lián)
1）將準(zhǔn)備好的樣品和100μl偶聯(lián)試劑添加到洗滌過的PuriMagTM磁珠中，充分混合，并在38~60℃下連續(xù)旋轉(zhuǎn)孵育48小時以上。
注意：用戶應(yīng)憑經(jīng)驗確定最佳的偶聯(lián)反應(yīng)時間和溫度。
2）用1ml偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠四次，然后用純水洗滌兩次。
注意：如果在50％乙醇中偶聯(lián)了不溶性配體，則應(yīng)先用50％乙醇洗滌珠子3次，然后用去離子水洗滌兩次，然后用100％乙醇洗滌兩次，最后用去離子水洗滌兩次
3）將磁珠重懸在含0.05％疊氮化鈉的緩沖液中，并保存在4℃下。
C. 一般親和純化方案
注意：設(shè)計通用的純化DNA或RNA的方案相對簡單，因為核酸的生化特性相對一致。但是，設(shè)計一種通用的親和純化方案非常困難，因為每種蛋白質(zhì)都有不同的組成和結(jié)構(gòu)。為了獲得最佳結(jié)果，每個用戶都必須為各個應(yīng)用程序確定最佳工作條件。
1）將最適量的磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中。磁分離1~3分鐘，除去上清液。
注意：強烈建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白的量進行滴定，以優(yōu)化用于每種應(yīng)用的磁珠的量。所用磁珠過多會導(dǎo)致較高背景，而所用磁珠太少則會導(dǎo)致較低產(chǎn)量。每mg的磁珠通常結(jié)合1~20 μg的目標(biāo)蛋白。
2）取下離心管，用5倍磁珠體積的PBS緩沖液懸浮30秒。磁分離1~3分鐘，除去上清。
3）重復(fù)步驟2兩次
4）將洗滌過的PuriMagTM磁珠加入含有目標(biāo)蛋白的粗樣品中，并在室溫或所需溫度下孵育1~2小時（較低的溫度需要更長的孵育時間）。
5）用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl充分洗滌磁珠，直到280 nm洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280 <0.05）。
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