羧基磁珠偶聯(lián)緩沖液套裝
PuriMag Buffer Kit for coupling of carboxyl bead
（Cat：PB0001）
1. 簡介
羧基磁珠是常用的偶聯(lián)載體，本試劑盒提供用于羧基與氨基的偶聯(lián)所需的緩沖液，譬如羧基微珠偶聯(lián)抗體、氨基修飾DNA等。
2. 試劑盒組成
緩沖液
體積
組成
注意
Coupling Buffer
（偶聯(lián)緩沖液）
50 ml
50 mM MES, pH 6.0, 0.01% Triton X-100
Coupling Agent
（偶聯(lián)試劑）
50mg×1
EDC；50 mg/ml×1ml （用前加入1ml Coupling Buffer）
盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，溶液保存不超過1個月
Sulfo-NHS；50 mg/ml×1ml （用前加入1ml Coupling Buffer）
Quench Buffer
（淬滅緩沖液）
TBS (25 mM Tris-Cl, 130 mM NaCl, 2.7 mM KCl), pH 8, 0.01% Triton X-100;
Storage Buffer
（儲存緩沖液）
10 ml
TBS or PBS containing 0.01% Triton X-100 or 0.01% Tween 20, 0.05%NaN3.
3. 兩步偶聯(lián)方案
本方案通過加入穩(wěn)定胺反應(yīng)性中間體的sulfo-NHS來增加EDC介導(dǎo)的反應(yīng)的效率。本方案中涉及的偶聯(lián)對象（蛋白、氨基修飾核酸、其它含伯氨基化合物）的使用量可根據(jù)需要進(jìn)一步優(yōu)化以達(dá)到最優(yōu)偶聯(lián)率。
1. 確保蛋白或配體在無胺偶聯(lián)緩沖液中。100μL偶聯(lián)緩沖液中需50?400μg蛋白用于偶聯(lián)。
2. 渦旋振蕩重懸羧基磁珠。吸取100μL磁珠到1.5mL的EP管中，磁分離并吸棄上清。
3. 加入200μL偶聯(lián)緩沖液。劇烈漩渦20秒，磁分離并吸棄上清。
4. 按步驟3再清洗羧基磁珠兩次。
5. 使用前用偶聯(lián)緩沖液配制EDC（50 mg / mL）。使用前用偶聯(lián)緩沖液配制Sulfo-NHS（50mg / mL）。
6. 向磁珠中加入60μL偶聯(lián)緩沖液、20μL新配的EDC溶液和20μL新配的Sulfo-NHS溶液?；靹?。
7. 室溫下混勻孵育15分鐘。磁分離并吸棄上清。
8. 用200μL偶聯(lián)緩沖液清洗磁珠。渦旋混勻，磁分離并吸棄上清。
9. 加入100μL偶聯(lián)緩沖液和50?400μg蛋白或配體。渦旋混勻。室溫下連續(xù)混合孵育0.5?4小時。
10. 將試管放入磁力架，磁分離吸棄上清。該上清液含未結(jié)合的配體，如優(yōu)化方案可保存用于分析。
11. 向羧基磁珠加入250μL淬滅緩沖液。渦旋20秒，磁分離并吸棄上清。
12. 向羧基磁珠加入500μL淬滅緩沖液。室溫孵育30?60分鐘。磁分離并吸棄上清。
13. 向羧基磁珠加入250μL淬滅緩沖液。劇烈漩渦20秒，磁分離并吸棄上清。
14. 從磁力架上取下EP管。添加100μL存儲緩沖液。渦旋混合并在2?8°C儲存偶聯(lián)好的磁珠。
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