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定量蛋白質(zhì)組學(xué)在過(guò)去十年中取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，成為生物和生物醫(yī)學(xué)研究的重要工具。然而，由于蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性，穩(wěn)健的蛋白質(zhì)組范圍測(cè)量仍然具有挑戰(zhàn)性。值得注意的是，蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)范圍很廣，細(xì)胞蛋白質(zhì)組跨越 7 個(gè)數(shù)量級(jí)，而一些生物流體（如血漿）跨越 10 個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，隨著該領(lǐng)域擴(kuò)展到包括單細(xì)胞測(cè)量，超高靈敏度比以往任何時(shí)候都更加重要。盡管技術(shù)取得了進(jìn)步，但在整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的定量靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度仍有改進(jìn)的空間。雖然經(jīng)常研究大量表征良好的蛋白質(zhì)，但對(duì)許多低豐度蛋白質(zhì)知之甚少。 因此，質(zhì)譜 （MS） 已成為全蛋白質(zhì)組定量測(cè)量的主要方法; 然而，進(jìn)一步推進(jìn)該領(lǐng)域需要不斷改進(jìn)硬件和數(shù)據(jù)采集技術(shù)。

MS 為全面的蛋白質(zhì)組范圍研究提供了前景，但在整個(gè)動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)仍然是一個(gè)尚未解決的挑戰(zhàn)。最近的研究報(bào)道了可檢測(cè)到大量蛋白質(zhì)：在 44 分鐘的運(yùn)行中檢測(cè)到多達(dá) 7700 個(gè)蛋白質(zhì)，在單次 120 分鐘的運(yùn)行中檢測(cè)到 10,000 個(gè)蛋白質(zhì)， 以及使用生化分級(jí)分離的超過(guò) 12,000 個(gè)蛋白質(zhì)。 這些結(jié)果突出了測(cè)量低豐度蛋白質(zhì)的難度越來(lái)越大。此外，這些研究各自實(shí)施了自己的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率和可量化峰值閾值，因此很難比較這些結(jié)果。即使是 1% 的標(biāo)準(zhǔn)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率 （FDR） 在不同的工具、工具和數(shù)據(jù)集中也可能具有截然不同的含義。不產(chǎn)生任何定量信息的測(cè)量會(huì)夸大數(shù)字，同時(shí)稀釋統(tǒng)計(jì)功效。然而，許多蛋白質(zhì)組學(xué)研究認(rèn)為定量是理所當(dāng)然的，很少有實(shí)驗(yàn)在顯著的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)對(duì)定量進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試。因此，對(duì)新技術(shù)進(jìn)行嚴(yán)格的分析評(píng)估，主要關(guān)注其定量能力，是技術(shù)開發(fā)周期的關(guān)鍵部分。

使用膜結(jié)合顆粒富集方法，我們使用 Orbitrap Astral 質(zhì)譜儀在單次 70 分鐘 LC-MS 運(yùn)行中定量了 5163 種蛋白質(zhì)。此處描述的基準(zhǔn)測(cè)試展示了 Astral 質(zhì)量分析儀在穩(wěn)定定量 DIA 方面的強(qiáng)大功能。

為了評(píng)估 Orbitrap Astral MS 產(chǎn)生新的生物學(xué)見解的潛力，我們測(cè)試了它在血漿上的性能，血漿基質(zhì)既常見又具有分析挑戰(zhàn)性。 雖然分級(jí)分離和富集策略提高了血漿蛋白質(zhì)組的覆蓋率，納米顆粒分級(jí)分離在 5 次運(yùn)行中檢測(cè) 1500-2000 個(gè)蛋白質(zhì)，而其他方法在一次運(yùn)行中可檢測(cè)多達(dá) 2700 個(gè)蛋白質(zhì) ，但血漿蛋白質(zhì)組仍然是一個(gè)艱巨的分析挑戰(zhàn)。解決動(dòng)態(tài)范圍問(wèn)題的兩種主要方法是增加質(zhì)譜儀本身的動(dòng)態(tài)范圍，或者使用富集或去除策略來(lái)減小我們正在測(cè)量的樣品的動(dòng)態(tài)范圍。在這里，我們通過(guò)使用高靈敏度的 Orbitrap Astral MS 來(lái)測(cè)量細(xì)胞外囊泡富集樣品中的血漿蛋白，從而應(yīng)用這兩種策略。

為了減小動(dòng)態(tài)范圍，我們使用了一種簡(jiǎn)單的基于磁珠的方案，該方案能夠從血漿中富集細(xì)胞外囊泡 （EV）。由于大多數(shù)豐度血漿蛋白與囊泡無(wú)關(guān)或位于囊泡內(nèi)，因此它們?cè)?EV 富集過(guò)程中被耗盡。使用 MagStart高孔聚合物基質(zhì)的組合富集 EV，該基質(zhì)用作膜結(jié)合顆粒的分子“網(wǎng)”。磁珠的聚合物基質(zhì)包含季銨鹽表面化學(xué)成分，產(chǎn)生陽(yáng)離子電荷（MagStart-SAX 磁珠）。多孔聚合物允許囊泡和生物分子嵌入珠子的體積內(nèi)，正電荷提供了一種根據(jù)電荷區(qū)分囊泡和脂蛋白顆粒的方法。該方案導(dǎo)致已知 EV 標(biāo)志物的富集約 20 倍，常見血漿蛋白的消耗約 95%。使用該方案，Wu 等人能夠?qū)⒖傃獫{中的 1088 個(gè)蛋白質(zhì)檢測(cè)（使用血漿 EV 生成的文庫(kù)）提高到富集血漿中的 4163 個(gè)。

為了評(píng)估基于 Astral 的儀器中的血漿蛋白質(zhì)組覆蓋率，我們?cè)u(píng)估了在富含 EV 的血漿和總血漿中具有短 （30 分鐘） 和長(zhǎng) （60 分鐘） 梯度的多種采集方法的定量性能。我們對(duì)每個(gè)梯度使用了多個(gè)隔離窗口大小和進(jìn)樣時(shí)間來(lái)評(píng)估這些參數(shù)的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于 30 分鐘梯度，我們?cè)?187 Hz（最大進(jìn)樣時(shí)間 3.5 ms，第 2 個(gè)隔離窗口）、90 Hz（最大進(jìn)樣時(shí)間 10 ms，第 4 個(gè)隔離窗口）和 50 Hz（最大進(jìn)樣時(shí)間 20 ms，第 4 個(gè)動(dòng)態(tài) DIA 窗口）下操作儀器。對(duì)于 60 分鐘的梯度，我們測(cè)試了兩種方法，均在 60 Hz（最大注射時(shí)間 15 ms）下運(yùn)行，一種使用 4 Th 靜態(tài)隔離窗口，另一種使用 2 Th 動(dòng)態(tài)隔離窗口。

不出所料，我們發(fā)現(xiàn)較長(zhǎng)的梯度比較短的梯度產(chǎn)生更多的肽和蛋白質(zhì)水平鑒定。60 min 梯度、4 Th分離窗口和 15 ms 最長(zhǎng)進(jìn)樣時(shí)間產(chǎn)生了最多的肽和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)結(jié)果，從 5163 個(gè)蛋白質(zhì)中獲得了 44,668 個(gè)肽。使用 30 min 梯度和 4 Th 分離窗口和 10 ms 的最大進(jìn)樣時(shí)間，我們從 4704 種蛋白質(zhì)中檢測(cè)到 37,534 種肽。通常，減慢采集速度以允許更長(zhǎng)的進(jìn)樣時(shí)間可以提高技術(shù)精度，盡管縮短 dDIA 的質(zhì)量范圍會(huì)減少肽和蛋白質(zhì)檢測(cè)的數(shù)量。這里評(píng)估的所有方法都檢測(cè)到了 4200 多種蛋白質(zhì)，具有很高的技術(shù)精度，這表明 Astral 非常適合這些類型的測(cè)量。此外，Astral 能夠檢測(cè)某些標(biāo)記蛋白的富集和耗竭，這些標(biāo)記蛋白相對(duì)于總血漿跨越較寬的動(dòng)態(tài)范圍）。 使用相同的富集方案，Wu 等人在 Thermo Scientific Orbitrap Eclipse MS 上以 110 分鐘的梯度檢測(cè)到來(lái)自 4163 種蛋白質(zhì)的 37,942 種肽。 Orbitrap Astral MS 能夠在 30 分鐘的梯度中檢測(cè)更多的蛋白質(zhì)和相似數(shù)量的肽，這突出表明 Astral 分析儀提高速度和靈敏度的一個(gè)好處是能夠在保持甚至增加覆蓋率的同時(shí)提高通量。

雖然技術(shù)精度和與已知生物學(xué)的一致性表明 Orbitrap Astral MS 產(chǎn)生的測(cè)量結(jié)果有意義，但很明顯，這些檢測(cè)中有一定比例可歸因于背景信號(hào)和化學(xué)噪聲。因此，為了確定高質(zhì)量肽和蛋白質(zhì)的比例，我們過(guò)濾了至少具有三個(gè)共洗脫通道的肽的結(jié)果。應(yīng)用該過(guò)濾器后，肽和蛋白質(zhì)的數(shù)量?jī)H略微減少，使用 dDIA 方法從 4453 個(gè)蛋白質(zhì)中達(dá)到最大值 31,373 個(gè)肽。過(guò)濾具有多個(gè)協(xié)變通道的肽的一個(gè)結(jié)果是消除了具有化學(xué)干擾的肽，從而提高了變異系數(shù)。在這里，增加進(jìn)樣時(shí)間可以改善離子統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，從而提高靈敏度和精密度。同樣，縮小隔離窗口可以提高測(cè)量選擇性并減少化學(xué)干擾。增加的進(jìn)樣時(shí)間和提高的選擇性都導(dǎo)致了檢測(cè)限的提高。即使使用相對(duì)嚴(yán)格的質(zhì)量過(guò)濾器，這里介紹的血漿蛋白質(zhì)組覆蓋率也是前所未有的。