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在前面的文章中我們和大家一起學(xué)習(xí)了RNA pull-down這種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，好學(xué)且好奇心強(qiáng)的小編又很快發(fā)現(xiàn)一種和它挺像的叫做DNA pull-down的新技術(shù)，再一起來(lái)看看吧。

一、原理概述

DNA pull-down是體外研究DNA與蛋白互作的有力工具。體外制備生物素標(biāo)記的靶DNA系列，使其與待測(cè)蛋白液孵育，形成“生物素化DNA-蛋白質(zhì)”復(fù)合物。由于生物素與鏈霉親和素間的作用是目前已知強(qiáng)度最高的非共價(jià)作用之間，因此采用鏈霉親和素磁珠將靶DNA及其結(jié)合蛋白從待測(cè)蛋白液中分離出來(lái)。通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)洗脫液中是否有待測(cè)蛋白，通過(guò)LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)靶DNA的潛在結(jié)合蛋白（如具體某個(gè)或某些轉(zhuǎn)錄因子/組蛋白等）。

二、實(shí)驗(yàn)流程

 一般來(lái)說(shuō)，該實(shí)驗(yàn)首先，需要針對(duì)待研究目的基因的調(diào)控區(qū)域設(shè)計(jì)并制備特異性探針（以脫硫生物素標(biāo)記為主流）；同時(shí)，制備細(xì)胞核提取物；將探針和核提取物共同孵育，DNA結(jié)合蛋白就會(huì)和靶向序列特異性結(jié)合；然后，通過(guò)親和素磁珠純化蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物；最后針對(duì)獲得的蛋白，使用western blot驗(yàn)證或者質(zhì)譜方式鑒定蛋白質(zhì)類(lèi)型。

優(yōu)點(diǎn)：

①　富集分析低豐度蛋白；

②　探針制備簡(jiǎn)便，周期短；

③　獲得特異性蛋白與下游蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)兼容；

缺點(diǎn)：

①　長(zhǎng)連探針往往存在非特異結(jié)合現(xiàn)象；

②　反應(yīng)條件要求無(wú)核酸酶；

③　體外實(shí)驗(yàn)，相對(duì)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)存在一定弊端；

以下為參考實(shí)驗(yàn)流程，不同實(shí)驗(yàn)室會(huì)有細(xì)微差異：

 

1．探針設(shè)計(jì)及標(biāo)記

（1）采用基因組DNA做模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子片段；

（2）將其克隆至克隆載體，并測(cè)序鑒定成功；

（3）使用PCR法或末端標(biāo)記法標(biāo)記探針；

（4）標(biāo)記的探針利用凝膠回收試劑盒純化回收探針，并檢測(cè)探針濃度；

（5） -20℃保存，待用；

2．Pull down

（1）　預(yù)先混合 5μg 生物素標(biāo)記的 DNA 和 500μg 核蛋白，置于冰上；

（2）　取 100μl 鏈霉親和素磁珠（PuriMag G-strep），用冰冷 PBS 洗一次，5000g 離心 30 秒；

（3）　將 DNA 與蛋白的混合物加到磁珠中，重懸磁珠；

（4）　4℃孵育 1 小時(shí)；

（5）　5000g，離心 30 秒，去除上清，收集沉淀；

（6）　用冰冷 PBS 洗磁珠三次，5000g 離心 1 分鐘，盡可能去除上清，收集沉淀；

（7）　 加入 30μl 蛋白上樣緩沖液，重懸沉淀，沸水煮 10 分鐘，

3．蛋白質(zhì)檢測(cè)-- western blot

（1）　電泳：實(shí)驗(yàn)采用不連續(xù)系統(tǒng)蛋白質(zhì)SDS-PAGE，濃度為5%濃縮膠和8~12%濃度分離膠；每孔上樣40~60ug總蛋白，開(kāi)始電壓為100v,到達(dá)分離膠后調(diào)為120v；

（2）　轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜為恒流轉(zhuǎn)膜，電流為200mA，時(shí)間根據(jù)目的蛋白分子量選擇60~120min。

（3）　封閉：蛋白膜放置到TBST溶液中，漂洗1-2分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；加入5%脫脂奶粉封閉液，室溫50rpm，封閉60分鐘。

（4）　孵育一抗：根據(jù)蛋白Marker指示將PVDF膜剪開(kāi)，參考一抗?jié)舛龋粚VDF膜分別放入含各自一抗溶液中，4度孵育一抗過(guò)夜，然后放入TBST洗滌液，搖動(dòng)洗滌3次，每次15min。

（5）　孵育二抗：參考二抗?jié)舛?，按比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗。將PVDF膜加入稀釋好的二抗，室溫?fù)u動(dòng)孵育1h；放入TBST洗滌液，搖動(dòng)洗滌3次，每次15min。

（6）　顯色：使用化學(xué)發(fā)光試劑，黑暗處顯色，用X光片壓片，顯影液及定影液洗片。

4．蛋白質(zhì)檢測(cè)-- MS

（1）　切膠：用刀片切取膠粒（膠粒直徑1-2mm），置于1.5ml EP管中。

（2）　清洗：用200ul MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘。

（3）　脫色：對(duì)于考染膠，加考染膠色液（25mM NH4HCO3， 50% ACN）200ul，37℃ 20分鐘或超聲脫色5分鐘，吸干，重復(fù)脫色2-3次，至藍(lán)色褪去。

（4）　脫水：加ACN 100ul脫水至膠粒變白，吸棄ACN。

（5）　清洗：用200ul MilliQ震蕩清洗2次，每次10分鐘；然后用200ul 50% ACN震蕩清洗2次，每次10分鐘。

（6）　脫水：加ACN 100ul 脫水至膠粒變白，吸棄ACN。

（7）　用25mM NH4HCO3稀釋Trypsin 至12.5mg/ml，每管加10ul，稍微離心一下，讓酶液與膠粒充分接觸，4℃放置30min ，待酶液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加25mM NH4HCO3 20ul，37℃過(guò)夜(16h)。

（8）　質(zhì)譜樣品使用德國(guó)Bruker公司的Ultraflex III質(zhì)譜儀開(kāi)展分析，參數(shù)設(shè)置：反射模式；

（9）　離子源加速電壓1為24kv；

（10）　加速電壓2為22kv；

（11）　離子延遲提取0.000ns；

（12）　真空度1.4×10-7 Torr；

（13）　質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加200次；

（14）　使用標(biāo)準(zhǔn)Maker峰作為外標(biāo)校正質(zhì)譜峰，正離子譜測(cè)定，測(cè)定范圍控制在700-4000；

（15）　樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜，胰酶自降解峰和污染物質(zhì)的峰自動(dòng)剔除；

（16）　利用LIFT軟件將PMF強(qiáng)度最大的5個(gè)峰進(jìn)行串級(jí)質(zhì)譜分析（峰強(qiáng)度大于300）。

DNA-pull dwon模式圖如下所示：

三、結(jié)果示意圖：

額，好像跟RNA pull-down確實(shí)很像，就是RNA換成了DNA，檢測(cè)的對(duì)象就變成了DNA與蛋白的互做。那么它有哪些應(yīng)用呢？

四．技術(shù)應(yīng)用

核酸與蛋白質(zhì)的互作是細(xì)胞功能的核心，包括蛋白質(zhì)合成、mRNA組裝等生命活動(dòng)中重要的代謝過(guò)程，研究核酸與蛋白質(zhì)的互作是研究生命科學(xué)的基本工具。DNA pull-down主要用于目的DNA片段的互作蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子等）篩選。

五、DNA pull down常見(jiàn)疑點(diǎn)解析

Q：1. 適配子DNA單鏈，可以用帶有互補(bǔ)鏈的磁珠進(jìn)行pull down嗎？如果可以，效率怎么樣？一般需要怎么優(yōu)化條件？
A：理論上說(shuō),若DNA單鏈能夠與磁珠上的互補(bǔ)鏈雜交成功,是可以進(jìn)行pull down實(shí)驗(yàn)的; 效率如何不好確定,這個(gè)取決于兩條DNA單鏈?zhǔn)欠衲茈s交成功、蛋白-DNA結(jié)合的強(qiáng)弱、蛋白的豐度等。

Q2： DNA pull down的 原理？
A：針對(duì)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性DNA探針并進(jìn)行生物素標(biāo)記，生物素探針可與偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素結(jié)合；細(xì)胞蛋白提取物與磁珠-DNA探針?lè)跤?，從而釣取與DNA探針有特異性結(jié)合的互作蛋白質(zhì)。

Q3： 你們對(duì)外服務(wù)的檢測(cè)項(xiàng)目有哪些？
A：細(xì)胞、動(dòng)物/植物組織、菌體都可以做DNA pull down, 我們還可以做的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)具體如下:

(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等;

(2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、雙熒光素酶、酵母單雜等;

(3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母雙雜等;

(4) 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：細(xì)胞增殖-MTT/CCK-8, 細(xì)胞凋亡, 細(xì)胞周期,細(xì)胞遷移、侵襲：劃痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等;

(5) 外泌體服務(wù)：提取、鑒定(Nanosight粒徑檢測(cè)/電鏡/WB)、測(cè)序(miRNA/lncRNA)、蛋白質(zhì)組學(xué);

(6) 轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組：真核有參轉(zhuǎn)錄組、無(wú)參轉(zhuǎn)錄組、真核lncRNA、small RNA等。


Q4：效率有多高？
A：效率主要取決于蛋白-DNA結(jié)合的強(qiáng)弱、蛋白的豐度等。

Q5：老師，對(duì)照組的DNA序列是怎么選擇的？
A：一般對(duì)照組是沒(méi)有探針的,對(duì)照組是磁珠beads+蛋白。

Q6：DNA pull down有什么缺陷嗎？
A：DNA pull down-MS是體外研究蛋白-DNA是否有直接互作的經(jīng)典技術(shù)，是將探針結(jié)合在凝膠/磁珠上，釣取與DNA探針有互作的蛋白；就技術(shù)而言,沒(méi)有明顯的缺陷;后續(xù)質(zhì)譜能鑒定到多少蛋白取決于蛋白-DNA結(jié)合的強(qiáng)弱、蛋白的豐度等。

Q7： 做DNA pulldown 用DNA單鏈好還是雙鏈好？
A：常規(guī)的是用DNA雙鏈作為探針。

Q8： 可以簡(jiǎn)單講一下生物素標(biāo)記引物的原理嗎？
A：主要利用生物素（biotin）和親和素（avidin）這兩種分子的獨(dú)特性質(zhì); 親和素的每個(gè)亞基都能結(jié)合一個(gè)生物素分子,兩者的結(jié)合是通過(guò)生物素的脲基環(huán)部分完成的;因此可將其戊酸側(cè)鏈通過(guò)酰胺鍵與核酸分子相連，構(gòu)成生物素標(biāo)記的核酸探針。

Q9： 如果做轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子和DNA結(jié)合發(fā)起轉(zhuǎn)錄，不應(yīng)是和打開(kāi)的單鏈結(jié)合嗎?
A：?jiǎn)?dòng)子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（結(jié)構(gòu)基因）5'端上游的DNA序列，就像"開(kāi)關(guān)"，決定基因的活動(dòng)，本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過(guò)與特定蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合而控制基因的活動(dòng)。轉(zhuǎn)錄因子就像一面"旗子"，指揮著酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases) 的活動(dòng)，這種酶制造著基因的RNA復(fù)制本。轉(zhuǎn)錄因子是與啟動(dòng)子DNA雙鏈結(jié)合的。

Q10：做100bp突變對(duì)照組應(yīng)該怎么突變堿基？
A：可以通過(guò)查找相關(guān)資料確定啟動(dòng)子發(fā)揮功能的核心區(qū)域,將核心區(qū)域進(jìn)行突變;一般是A/G互換,C/T互換突變。

Q11： DNA互補(bǔ)鏈可以相互釣取嗎？
A：DNA pull down 是研究蛋白-DNA的互作,不可以用DNA互補(bǔ)鏈相互釣取。

Q12：請(qǐng)問(wèn)DNA為什么會(huì)與蛋白質(zhì)互作呢，它們有什么功能的聯(lián)系嗎？
A：DNA pulldown 是研究蛋白-DNA的互作, 主要應(yīng)用于尋找已知的啟動(dòng)子序列所結(jié)合的未知蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）；啟動(dòng)子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（結(jié)構(gòu)基因）5'端上游的DNA序列，就像"開(kāi)關(guān)"，決定基因的活動(dòng)，本身并不控制基因活動(dòng)，而是通過(guò)與特定蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)錄因子）結(jié)合而控制基因的活動(dòng)。

Q13： 如果做小肽對(duì)細(xì)菌的作用是否也可以DNA pull down？
A：小肽屬于蛋白類(lèi), 做不了DNA pull down。

Q14：未加探針的對(duì)照組鑒定出蛋白是什么原因呢？
A：對(duì)照組是磁珠beads+蛋白，雖然沒(méi)有探針，但少量蛋白可以與磁珠相結(jié)合，對(duì)照組鑒定到的蛋白是非特異性的背景蛋白。

用于pull-down的鏈霉親和素磁珠請(qǐng)參考:

 http://m.5000js.com/Product/8271042221.html (200nm鏈霉親和素磁珠)

http://m.5000js.com/Product/9728163513.html (1um鏈霉親和素磁珠)