CRISPR/Cas9基因魔剪成了分子診斷的新幫手
“分子診斷”聽起來非?！案叽笊稀?，其實(shí)大家早已不陌生：
要獻(xiàn)血？血站采血之后要檢測乙肝（HBV）、丙肝（HCV）和艾滋?。℉IV）等病毒。
要生娃？抽點(diǎn)血來產(chǎn)前篩查（地中海貧血、血友病、耳聾基因檢測等）和新生兒篩查。
想看有沒有患癌風(fēng)險(xiǎn)？來做個(gè)腫瘤早期篩查吧，看你是不是有腫瘤易感基因。
……
這一切都離不開分子診斷技術(shù)。
核酸分子，是一切生命形式最基本的遺傳物質(zhì)。分子診斷技術(shù)通過對核酸分子的快速準(zhǔn)確鑒定，能夠提供各類疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)、病因和基因型等信息，從而為疾病的預(yù)防、監(jiān)控和治療提供相應(yīng)依據(jù)。
目前最為成熟、應(yīng)用最為廣泛的分子診斷技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR技術(shù))。但是，由于該技術(shù)操作復(fù)雜、儀器昂貴、還涉及多重變溫過程，使得該技術(shù)在現(xiàn)場和家庭檢測領(lǐng)域的應(yīng)用中受到了極大限制。
中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院副研究員周文華博士等利用CRISPR系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Cas9在與靶核酸分子結(jié)合過程中獨(dú)特的構(gòu)象變化，高效啟動針對靶核酸分子的指數(shù)倍擴(kuò)增（簡稱CRISDA技術(shù)），可在1小時(shí)左右將極低濃度的特征性靶核酸復(fù)制至足夠被檢測到的濃度，而且無需經(jīng)過任何變溫過程。相關(guān)研究成果已發(fā)表在國際權(quán)威刊物《自然·通訊》（Nature Communications）上，文章共同第一作者為周文華副研究員和胡麗研究助理，通訊作者是喻學(xué)鋒研究員(Nat.Commun.2018, 9, 5012)。相關(guān)技術(shù)也已申請專利保護(hù)。
研究成果以長文形式發(fā)表于國際權(quán)威刊物《自然·通訊》雜志
PCR：循環(huán)變溫是我的短板
PCR技術(shù)是一種在體外擴(kuò)增DNA分子的技術(shù)，通過在待擴(kuò)增的DNA片段兩側(cè)設(shè)計(jì)兩條寡核苷酸引物，經(jīng)過多重循環(huán)后，實(shí)現(xiàn)靶DNA分子的指數(shù)倍擴(kuò)增。
PCR過程示意圖
然而，由于PCR的每個(gè)循環(huán)過程包括了高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個(gè)溫度不同的事件，對儀器的精確控溫要求極高。市面上的PCR熱循環(huán)儀價(jià)格普遍在數(shù)萬至數(shù)十萬元之間，若想要在家庭、社區(qū)或基層檢測機(jī)構(gòu)中實(shí)現(xiàn)普遍性使用仍是一大難題。
為了克服PCR技術(shù)的缺點(diǎn)，一類不依賴變溫的檢測技術(shù)，即等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)得到了廣泛關(guān)注。這些技術(shù)由于反應(yīng)溫度單一，不受熱循環(huán)儀的制約，正逐漸在特定領(lǐng)域取代PCR。但是當(dāng)前，等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在體系復(fù)雜程度、靈敏度、特異性和抗干擾能力等方面仍存在著缺陷。更重要的是，目前所有成熟的等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)的核心專利均掌握在國外公司手中。
因此，開發(fā)出一種性能優(yōu)異、具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)的核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測新技術(shù)，對滿足我國分子診斷領(lǐng)域日益增長的需求、提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的國際競爭力意義重大。
基因魔剪變身“搜索引擎+雙鏈開關(guān)”
大名鼎鼎的CRISPR/Cas9系統(tǒng)被稱為“基因魔剪”，在基因調(diào)控和基因編輯等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，該系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白（Cas9蛋白）能夠識別特定基因序列，并對識別靶點(diǎn)附近的 DNA 雙鏈進(jìn)行剪切。
CRISPR/Cas9技術(shù)機(jī)理示意圖。一段與靶核酸序列互補(bǔ)的sgRNA（引導(dǎo)RNA）分子與CRISPR的效應(yīng)蛋白Cas9形成Cas9-sgRNA復(fù)合體后，可在復(fù)雜條件下自主尋找靶核酸分子，并一步完成特異性結(jié)合與切割。（圖片來源：研究團(tuán)隊(duì)）
早在2015年初，當(dāng)世界上絕大多數(shù)課題組都將精力和資源投入到CRISPR基因治療領(lǐng)域時(shí)，該團(tuán)隊(duì)就率先意識到CRISPR體系在分子診斷領(lǐng)域?qū)⒂芯薮蟮膽?yīng)用前景和優(yōu)勢：該技術(shù)操作簡便、靈敏度高、抗干擾性強(qiáng)。“可以說，當(dāng)時(shí)我們是在世界范圍內(nèi)最早提出這一設(shè)想的課題組之一?！敝芪娜A說。
經(jīng)過三年不斷的努力，第一代CRISDA技術(shù)已逐漸成熟。
在CRISDA反應(yīng)中，Cas9蛋白就像一個(gè)具有主動搜尋功能的"開關(guān)",在找到具有某一疾病或某一特征相關(guān)的特定靶DNA序列后，能高效起始該靶核酸的指數(shù)倍“復(fù)制”過程。整個(gè)反應(yīng)過程可在從室溫到45度的條件下高效進(jìn)行，對溫度要求極低。
實(shí)驗(yàn)過程中，Cas9-sgRNA復(fù)合體在復(fù)雜溶液條件下主動搜尋靶核酸分子并與之結(jié)合切割，切割后的靶DNA分子被解旋并暴露出單鏈區(qū)域，擴(kuò)增引物進(jìn)一步與該區(qū)域結(jié)合形成后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)的“開關(guān)”結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)在擴(kuò)增酶類的作用下，起始靶核酸分子的指數(shù)倍鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)。
CRISDA技術(shù)作用機(jī)理簡圖。（圖片來源：研究團(tuán)隊(duì)）
“在實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域，對特定序列的核酸進(jìn)行檢測的難度在于如何對極低濃度的靶核酸分子進(jìn)行特異性高效擴(kuò)增。而對特異性擴(kuò)增后的產(chǎn)物的檢測，目前市場已有多種成熟的手段，并不是技術(shù)難點(diǎn)?！敝芪娜A介紹說。
然而，課題組將CRISPR體系作為核酸等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的開關(guān)，并應(yīng)用于分子診斷領(lǐng)域的研究尚屬首次。同時(shí)，CRISDA技術(shù)背后原理十分復(fù)雜，為了實(shí)現(xiàn)這一基因快檢技術(shù)，團(tuán)隊(duì)在研發(fā)過程中也經(jīng)歷了多重考驗(yàn)?！翱梢哉f我們當(dāng)時(shí)是在一個(gè)完全未知的領(lǐng)域探索，每個(gè)技術(shù)細(xì)節(jié)都是靠我們不斷的嘗試和優(yōu)化來實(shí)現(xiàn)的。” 周文華提到。
CRISDA：四大優(yōu)勢
目前，研究團(tuán)隊(duì)已通過兩步反應(yīng)，在90分鐘內(nèi)，對極微量（20 μL）復(fù)雜溶液樣品中的個(gè)位拷貝數(shù)的靶核酸分子成功實(shí)現(xiàn)了等溫?cái)U(kuò)增檢測，如人基因組片段、乳腺癌致病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的突變位點(diǎn)或轉(zhuǎn)基因大豆基因組等。CRISDA技術(shù)在這一極微量體積和極低濃度下的優(yōu)異性能，可完全滿足目前分子診斷中，針對循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）和循環(huán)游離胎兒DNA（cffDNA）等檢測的需求。
利用CRISDA技術(shù)對aM量級的靶分子進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）擴(kuò)增檢測。（a）不同細(xì)胞株基因組中rs3803662位點(diǎn)的測序驗(yàn)證；（b）利用CRISDA技術(shù)對該SNP位點(diǎn)進(jìn)行高靈敏度擴(kuò)增檢測。（圖片來源：論文）
CRISDA技術(shù)在諸多方面均優(yōu)于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，
首先，在靈敏度方面，由于CRISDA技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比具有更優(yōu)異的抗干擾性，其可在復(fù)雜背景條件下，對aM（10-18M）濃度的靶核酸分子進(jìn)行高效擴(kuò)增檢測。而在相同條件下，PCR技術(shù)由于抗干擾能力較差，無法實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增。
其次，在特異性方面，CRISDA技術(shù)無需優(yōu)化即可實(shí)現(xiàn)對極低濃度的靶核酸分子進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測。而PCR技術(shù)要實(shí)現(xiàn)SNP檢測則需通過聯(lián)合測序、酶反應(yīng)或者多重引物等條件來實(shí)現(xiàn)，其成本和復(fù)雜程度無法滿足快速分子診斷的需求。
第三，在普適性方面，在CRISDA檢測反應(yīng)中，所需的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)簡單，無需優(yōu)化即可迅速實(shí)現(xiàn)對新位點(diǎn)的檢測反應(yīng)體系開發(fā)。而PCR反應(yīng)或其他等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)則需經(jīng)過大量優(yōu)化。目前，課題組已利用該技術(shù)成功檢測出人基因組中乳腺癌相關(guān)的單核苷酸位點(diǎn)突變，并在野生型大豆中成功檢測出萬分之三的轉(zhuǎn)基因大豆。
第四，在操作難度方面，CRISDA技術(shù)無需依賴儀器，僅通過簡單操作，即可在90分鐘內(nèi)即可完成從富集到擴(kuò)增檢測的全部過程。且整個(gè)過程對溫度依賴極低。而傳統(tǒng)的PCR技術(shù)則需依賴多步繁瑣操作，過程耗時(shí)4小時(shí)，且對儀器控溫要求極高。
傳統(tǒng)PCR技術(shù)與CRISDA檢測技術(shù)對比（圖片來源：研究團(tuán)隊(duì)）
此外， CRISDA技術(shù)可與一步法CRISPR靶向核酸富集技術(shù)完美結(jié)合，在進(jìn)一步提升CRISDA檢測性能的基礎(chǔ)上，解決了核酸提取這一困擾分子診斷領(lǐng)域的技術(shù)痛點(diǎn)。例如，利用該一步法CRISPR靶向核酸富集技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜樣品中的靶核酸分子特異性提取，可極大地縮短血篩檢測樣品前處理的難度和復(fù)雜程度。同時(shí)，這一技術(shù)也為未來CRISDA技術(shù)在基層和家庭推廣奠定了基礎(chǔ)。
未來：在家就能做診斷……
近期，周文華等提出的以該技術(shù)為背景的“基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的核酸高敏快速等溫檢測技術(shù)”項(xiàng)目在中科院首屆“率先杯”未來技術(shù)創(chuàng)新大賽中，從近千個(gè)項(xiàng)目中脫穎而出，獲得最終決賽優(yōu)勝獎?！澳銈兊募夹g(shù)想法非常獨(dú)到，很好地利用了CRISPR技術(shù)的特點(diǎn)，并展現(xiàn)了該技術(shù)相比于傳統(tǒng)PCR技術(shù)的優(yōu)勢。我相信這一技術(shù)未來在核酸分子檢測領(lǐng)域?qū)⒂兄浅Ｖ匾囊饬x。”大賽評委點(diǎn)評中提到。
目前，團(tuán)隊(duì)也正在積極和分子診斷行業(yè)的龍頭企業(yè)開展深入合作，將該技術(shù)應(yīng)用于突發(fā)或新型傳染病的檢測，如新型流感，非洲豬瘟等。
未來，團(tuán)隊(duì)計(jì)劃基于CRISDA技術(shù)，開發(fā)出名片大小的一次性微流控生物芯片，服務(wù)于遺傳病篩查、流行病診斷、食品安全和公共安全等領(lǐng)域，充分滿足從現(xiàn)場檢測到家庭檢測的市場需求。
“我們設(shè)想未來僅需極少量的生物樣本，利用CRISDA的生物芯片就能在家零門檻檢測老人或兒童患的是普通感冒還是新型病毒性流感?！敝芪娜A暢想道，“同時(shí)，CRISDA家庭檢測儀所獲得的結(jié)果將實(shí)時(shí)上傳到家庭所注冊的社康中心，家庭醫(yī)生將結(jié)合檢測結(jié)果和最近從社區(qū)到地區(qū)的流行病風(fēng)險(xiǎn)變化迅速給出最有效的治療方案。我們希望這一切都能在家庭完成，從而提高患者的診療效率，避免到醫(yī)院就診過程中的交叉感染，并減少三甲醫(yī)院的壓力，充分發(fā)揮基層社康中心的分級能力?！?
CRISDA檢測系統(tǒng)原理（圖片來源：研究團(tuán)隊(duì)）
該團(tuán)隊(duì)的研究展示了基于CRISPR-Cas9的核酸等溫檢測技術(shù)在醫(yī)療診斷和食品安全領(lǐng)域巨大的應(yīng)用前景，同時(shí)也為其他具有類似特性的系統(tǒng)或蛋白在應(yīng)用上提供了新思路和方法。這一系列研究將有可能推動分子診斷技術(shù)和產(chǎn)品從目前的專業(yè)機(jī)構(gòu)延伸至基層乃至家庭。
作者單位：中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
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