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一、概述
氨基活化瓊脂糖磁珠（Magarose-NH2）是一種6%交聯(lián)的磁性瓊脂糖微球，磁珠在長(zhǎng)間隔臂的末端含有反應(yīng)性伯胺，含有羧基（-COOH）的分子共價(jià)偶聯(lián)，用于親和純化。凝膠對(duì)于固定肽而言是理想的，用于抗體或其他結(jié)合配偶體的親和純化。
盡管其他胺反應(yīng)性方法可將分子固定化在氨基活化瓊脂糖磁珠上，但碳二亞胺（EDC）在交聯(lián)劑中是獨(dú)特的，使得能夠通過-COOH偶聯(lián)。在近中性至酸性pH緩沖液中，EDC能有效地與羧酸鹽反應(yīng)形成中間體酯，其與親核試劑如氨基活化瓊脂糖磁珠上的伯胺反應(yīng)。在大多數(shù)親和純化方法中，分子和瓊脂糖凝膠載體之間產(chǎn)生的酰胺鍵是穩(wěn)定的，并且可防滲漏。
氨基活化瓊脂糖磁珠也適用于通過5'-磷酸基團(tuán)固定寡核苷酸。在咪唑存在下，EDC以與羧酸鹽大致相同的方式有效地與磷酸基團(tuán)反應(yīng)。
二、產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱
Magarose-NH2
貨號(hào)
PMAG018，PMAG019
磁珠濃度
25% (v/v) in 0.02% sodium azide
配基密度
~ 60 μmol NH2/ ml磁珠
介質(zhì)
6%交聯(lián)磁性瓊脂糖
粒徑
20-45μm
配體結(jié)合
>20 mg IgG/ml磁珠
保存
常溫運(yùn)輸，2~8℃保存一年
注：磁珠蛋白結(jié)合量與目標(biāo)蛋白特性相關(guān)，此處僅作參考值。
三、使用方法
1. 重要產(chǎn)品信息
? 使用EDC時(shí)，氨基磁珠將與C-末端、天冬氨酸或谷氨酸殘基的側(cè)鏈-COOH相偶聯(lián)。因?yàn)殡倪€含有伯胺（N-末端和賴氨酸殘基的側(cè)鏈），使用EDC的偶聯(lián)將導(dǎo)致肽的聚合以及它們固定到凝膠支持物上。通常這種聚合對(duì)隨后的親和純化方法無害。
? 連接水不溶性肽或其他分子時(shí)，請(qǐng)使用與水混溶的溶劑，如乙醇、甲醇、DMSO或DMF。首先將肽溶解在水混溶性溶劑中，然后將該溶液加入偶聯(lián)緩沖液中。偶聯(lián)反應(yīng)中高達(dá)50％的有機(jī)溶劑濃度是相容的，除非已知肽在該濃度下變性。
? 傳統(tǒng)上，MES緩沖液用于EDC反應(yīng)，因?yàn)樗缓懈?jìng)爭(zhēng)性的胺或磷酸鹽，并且有效地保持了最佳的偶聯(lián)酸條件。然而，如果需要，可以替換其他緩沖液，并且偶聯(lián)將有效地進(jìn)行至pH 7.2。盡管磷酸鹽緩沖液可以與EDC反應(yīng)，但降低偶聯(lián)效率。乙酸鹽、Tris和甘氨酸緩沖液與EDC或O-?；愲逯虚g體反應(yīng)，不是合適的偶聯(lián)緩沖液。另外，避免使用含有硫醇的緩沖液，這些硫醇不可逆地結(jié)合EDC并使之失活。碘化物、氯化物和溴化物等鹵化物對(duì)pH值為5和7之間的EDC幾乎沒有影響。
? EDC / Magarose-NH2方法也可用于通過5'-磷酸基團(tuán)固定寡核苷酸。
2. 使用EDC和Magarose-NH2的肽固定化方法
注意：此方法使用2mL 磁珠Magarose-NH2（8mL漿液）偶聯(lián)1-10mg肽。對(duì)于其他體積、肽量請(qǐng)相應(yīng)調(diào)整程序。
A. 所需材料
· 偶聯(lián)緩沖液：0.1M MES緩沖液[2-（N-嗎啉代）乙磺酸]，0.9％NaCl，pH4.7
? 洗滌液：1M NaCl
? EDC [1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺HCl]
B. 試劑制備
將1-10mg肽溶解在2mL偶聯(lián)緩沖液中。為了估計(jì)肽偶聯(lián)后的偶聯(lián)效率，測(cè)量該樣品在280nm處的吸光度。（該方法假設(shè)肽在280nm處吸收，可以使用檢測(cè)肽的存在的其他波長(zhǎng)與單獨(dú)的偶聯(lián)緩沖液）。
C. 磁珠準(zhǔn)備
小心地將8mL 磁珠移入玻璃瓶，磁分離，移除上清液。加入10ml偶聯(lián)緩沖液平衡磁珠。磁分離，去除上清，磁珠備用。
D. 肽偶聯(lián)
1) 在打開前將EDC樣品瓶平衡至室溫，以避免水分凝結(jié)到樣品瓶中。
2) 將2mL制備的肽樣品加入磁珠中，輕輕顛倒混合樣品/磁珠漿液數(shù)分鐘。
3) 將0.5mL偶聯(lián)緩沖液加入60mg EDC中。
注意：EDC對(duì)水分敏感，當(dāng)溶解在水性緩沖液中時(shí)會(huì)迅速水解。為獲得最佳效果，請(qǐng)將干粉試劑密封在-20°C的干燥劑中密封在其原始樣品瓶中。在使用前立即快速溶解所需量的試劑，并丟棄任何未使用的溶液。
4) 在EDC溶解后，立即將0.5mLEDC溶液加入步驟2的樣品/磁珠漿液中。在室溫下輕輕混合反應(yīng)漿3小時(shí)。
5) 磁分離，移除上清液。加入2mL洗滌液，磁分離，收集上清液。將兩部分上清液混合，用于測(cè)定偶聯(lián)效率。
注意：收集的樣品（~4mL）含有未結(jié)合的肽。為了測(cè)量偶聯(lián)效率，比較該溶液與起始肽樣品的吸光度，考慮2倍稀釋效應(yīng)。
6) 向磁珠中加入2mL洗滌液，洗滌三次。
7) 磁分離后的磁珠，用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）或含有0.05％疊氮化鈉的其它合適緩沖液平衡，4℃下保存。
3. 通過5'-磷酸基團(tuán)固定核酸或寡核苷酸的方法
注意：每1μg待偶聯(lián)的寡核苷酸使用1μL凝膠（4μL混合漿液）。
? 0.1M咪唑，pH6
? 超純DNase和/或RNase水
B. 核酸或寡核苷酸偶聯(lián)
1) 混合Magarose-NH2漿液，以獲得均勻的磁珠懸浮液。使用移液槍將適量的磁珠轉(zhuǎn)移到微量離心管中。
2) 磁分離并棄去上清液。
3) 用2個(gè)磁珠沉降體積的超純水清洗磁珠3-5次，磁分離并每次除去上清液。
4) 對(duì)于每微升使用的磁珠，在1μL的0.1M咪唑（pH6）中溶解至多10μg的DNA或RNA。
5) 將核酸溶液加入凝膠中并充分混合。
6) 稱取1mg 的EDC并溶解在67μL的0.1M咪唑中（pH6）。
7) 對(duì)于每微升磁珠，加入2μL的EDC溶液。
8) 在室溫下?lián)u動(dòng)或混合反應(yīng)3小時(shí)。
9) 磁分離并除去含有未結(jié)合核酸的上清液。
10) 用2個(gè)磁珠體積的水或適當(dāng)?shù)南礈煲海ɡ鏣ris-EDTA）洗滌磁珠3-5次，離心并每次棄去上清液。
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