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1. 產(chǎn)品描述
1.1 產(chǎn)品用途
谷胱甘肽修飾磁珠PuriMag Si-GSH 非常適合用于小型規(guī)模的GST標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)純化。
1.2 原理
把含有GST標(biāo)簽的融合蛋白添加到PuriMag Si-GSH磁珠中，在經(jīng)過短暫的孵育后，重組蛋白將被吸附到磁珠上，然后可使用磁珠分離架把GST融合蛋白洗脫下來。磁分離技術(shù)消除了微管的變化、最大限度地減少樣品的損失和消除繁雜傳統(tǒng)離心方法的步驟，而且適合于自動(dòng)化操作。
1.3 材料的描述
PuriMag Si-GSH磁珠是由還原型谷胱甘肽共價(jià)結(jié)合在的400nm的超順磁性微球表面組成，表面二氧化硅層可最大限度降低非特異性蛋白的吸附。磁珠儲(chǔ)存在含有20%乙醇的PBS（PH=7.4）中，每1mg磁珠能夠吸附超過40ug以上的GST標(biāo)簽融合蛋白。
1.4 產(chǎn)品保存
產(chǎn)品能夠2-8℃穩(wěn)定存儲(chǔ)，避免冷凍。在存儲(chǔ)和所有操作中保證磁珠浸沒液體中，干燥的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致吸附量的下降或喪失。使用前應(yīng)充分懸浮磁珠，避免細(xì)菌和真菌污染。
2. 操作流程
該說明書以100 μl的 PuriMag Si-GSH磁珠為例，您可根據(jù)需要進(jìn)行放大或者縮小。
2.1 細(xì)胞破碎液和緩沖液準(zhǔn)備
從大腸桿菌細(xì)胞中制備含有GST標(biāo)簽的重組蛋白，可采用高壓勻漿或超聲破碎等方法。
過程所需緩沖液：（1）上樣Buffer/洗雜Buffer: 1x PBS pH=7.4 （2）洗脫Buffer: 10mM GSH（還原型谷胱甘肽）, 50mM Tris，pH 8.0
2.2 使用前準(zhǔn)備
1）充分搖勻磁珠。
2）取100μl磁珠到一個(gè)干凈的管中。
3）把管放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。
4）加入1ml 洗雜/上樣Buffer充分混勻后，放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。重復(fù)該次步驟2次。
2.3 融合蛋白結(jié)合
1) 用100μl的上樣Buffer/洗雜Buffer重新懸浮磁珠。
2) 加入含有GST標(biāo)簽重組蛋白的樣品輕輕混勻。
3) 放置在振蕩器或搖床中在室溫下孵育30-60min（如果重組蛋白在室溫下不穩(wěn)定，可以再4℃進(jìn)行）。
4) 把孵育后的小管放置在磁力架上收集磁珠，去上清液。如果有需要可保留上清，另作檢測(cè)。
5) 加入1ml 洗雜/上樣Buffer充分混勻后，放在磁力架上收集磁珠，去上清。重復(fù)該次步驟至少3次。
2.4 目的蛋白洗脫
1) 加入100μl洗脫Buffer重新懸浮磁珠，放置在振蕩器上室溫震蕩5min
2) 使用磁力架收集磁珠，把上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的管中。
3) 重復(fù)步驟1和步驟2.
3. 問題解決方法
問題
可能原因
解決方案
GST融合蛋白產(chǎn)量低或無目的蛋白
融合蛋白是以包涵體表達(dá)
降低培養(yǎng)溫度，把IPTG的濃度減少到10mM，或者適當(dāng)減少誘導(dǎo)時(shí)間；
將表達(dá)的包涵體進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖冃院椭匦抡郫B。
使用的磁珠太少
增加磁珠使用量。
上樣樣品太少
增加上樣樣品量。
融合蛋白沒有活性
使用更加溫和的破碎方法，如加入溶菌酶破碎細(xì)胞，防止目的蛋白變性。
融合蛋白降解
在細(xì)胞破碎液和洗雜Buffer中加入適量的PMSF。
融合蛋白不能有效的洗脫下來
增加洗脫時(shí)間或者增加洗脫液的濃度到15mM或更高濃度的谷胱甘肽；
調(diào)節(jié)洗脫液的PH到8.0-9.0；
在洗脫Buffer加入Triton X-100（終濃度0.1%）、Noctylglucoside（終濃度2%）或者NaCl（終濃度0.1-0.2M）。
洗脫液中有多個(gè)條帶.
融合蛋白被分解
再細(xì)胞破碎液和洗雜Buffer中加入適量的PMSF。
一些馬的蛋白，如分子伴侶會(huì)與GST融合蛋白結(jié)合
在洗雜Buffer中加入5mM的DTT。將含有目的蛋白破碎液置于chaperonin Buffer（2MmATP，10mM MgSO4，50mM Tris-HCl）37℃孵育10min，再進(jìn)行純化。
超聲破碎可能會(huì)導(dǎo)致一些蛋白和融合蛋白結(jié)合
使用更加溫和的破碎條件或者更換破碎方法。
一些蛋白會(huì)非特異性結(jié)合到融合蛋白或者填料上
優(yōu)化洗雜條件，加入1% TritonX-100,1% Tween-20,1% CTAB,10mM DTT，0.03% SDS或0.1% NP-40。這些試劑能夠幫助去除一些非特異性吸附。
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