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一、概述
PuriMag G-Oligo (dT)25磁珠用于從總 RNA或直接從動物組織、植物細胞中快速分離出高純度且完整的mRNA。可以廣泛應(yīng)用到各種樣品中。磁珠上的 oligo-dT 與 mRNA的 polyA雜交，僅需幾步洗滌、洗脫和磁分離，即可獲得高純度的mRNA。所有操作都在單管中一次完成，操作簡單易行。
二、產(chǎn)品特性
粒徑：200 nm
結(jié)合能力：~2 ug mRNA/mg bead
（注意：每mg磁珠可純化~ 2 μg mRNA. 一個典型動物細胞含10–30pg的RNA，其中1–5% 是mRNA. 每mL磁珠可純化10μg的mRNA，若磁珠重復(fù)利用5次，則每mL磁珠可純化50μg的mRNA。）
濃度：5 mg/mL
保存液：0.1 M Tris-HCl，pH 7.5, 20 mM EDTA，含0.1%（v/v）Tween -20，0.1%（w/v）NaN3
儲存：2~8 °C保存，勿凍結(jié)。常溫運輸，正確使用保存期一年。
三、緩沖液
結(jié)合緩沖液：20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1.0 M LiCl, 2 mM EDTA.
裂解/結(jié)合緩沖液：100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 500 mM LiCl, 10 mM EDTA, 1% LiDS, 5 mM dithiothreitol (DTT).
洗滌液A：10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA, 0.1% LiDS.
洗滌液B：10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.15 M LiCl, 1 mM EDTA 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.
四、注意事項
實驗操作：在進行RNA實驗時，必須注意要抑制RNase的作用。因此，除了要防止通過使用器具以及試劑中混入RNase，即注意實驗環(huán)境之外，還要防止通過唾液、汗等混入RNase，建議戴上口罩和手套。
器材：在實驗器材允許情況下，對一次性塑料制品高溫高壓濕熱滅菌處理。在使用玻璃器皿的情況下，請干熱滅菌，或在0.1% DEPC溶液中，37℃下浸泡12h，再高溫高壓濕熱滅菌（121℃，30分鐘）。
五、操作流程
1. 磁珠預(yù)處理
（1）將磁珠懸液漩渦振蕩30 s，使磁珠充分重懸；
（2）取出100 μL磁珠懸液至1.5 mL EP管中；磁分離，移去上清液，從磁分離器上取下反應(yīng)管；
（3）加入1mL結(jié)合緩沖液重懸磁珠，用移液器緩慢吹打5~10次或漩渦震蕩30 s，磁分離，去上清。
（4）加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸磁珠。
2. 樣品前處理
對應(yīng)樣品
樣品量
磁珠量
動物組織
~50 mg
100 μL
植物組織
~100 mg
培養(yǎng)細胞
~1×107
總RNA
~100μg
（1）動物/植物組織
a. 將所需量的植物或動物組織在液氮中研磨成粉末，保持冷凍狀態(tài)，避免RNA降解。
b. 將一定量（參考樣品對照表）冷凍粉收集并轉(zhuǎn)移到新的EP管中，添加1mL裂解/結(jié)合緩沖液，勻漿器勻漿1-2min至裂解完全。該步驟盡量快速操作，避免mRNA降解。
c. 在室溫下以14,000rpm離心1 min，并將所有上清液轉(zhuǎn)移至一個新的EP管。上清液可用于mRNA純化，或保存在-80℃?zhèn)溆谩?
（2）細胞懸浮液
a. PBS緩沖液中清洗細胞，室溫下以4,000rpm離心5min沉淀細胞并丟棄上清液。
b. 每1-4×106個動物或植物細胞加1ml裂解/結(jié)合緩沖液。通過移液吹打多次裂解細胞至溶液變粘稠。
c. 通過DNA剪切降低粘度。用1-2注射器通過21#針頭三次吸入和吸出剪切裂解液中的DNA來降低溶液粘度?？赡軙a(chǎn)生泡沫，但不影響mRNA的得率。
d. 在室溫下以14,000rpm離心5min，并將所有上清液轉(zhuǎn)移至一個新鮮的EP管。上清液可進行mRNA純化，或保存在-80℃以備將來使用。
3. 提取mRNA
a. 制備動物/植物組織裂解液或從培養(yǎng)細胞和細胞懸浮液中制備裂解液。
b. 對磁珠進行預(yù)處理。
c. 將裂解液與磁珠混合（參考樣品對照表），室溫下旋轉(zhuǎn)混合3-5分鐘。
d. 磁分離，靜置2min，去上清。
e. 室溫下分別用1ml洗滌液A和1ml洗滌液B清洗磁珠，去除可能的污染物。
f. 進入如下之一操作：
如果分離mRNA用于酶促下游應(yīng)用（例如固相cDNA合成），洗滌液B（500μL）洗滌一次，隨后用酶緩沖液洗滌一次，可用于下游應(yīng)用。
如從磁珠中洗脫mRNA，洗滌液B洗滌后并加入10～20μl的10mMTris-HCl，75~80°C孵育2min，然后快速將含mRNA的上清轉(zhuǎn)移到新RNase-free的EP管。
4. Total RNA中純化mRNA
（以純化75ug Total RNA中mRNA為例）
a. 取100uL含有75ug Total RNA 與100uL結(jié)合緩沖液混合。（若Total RNA含量低于75ug/100uL，直接混合；若Total RNA含量高于75ug/100uL，用DEPC水稀釋至75ug/100uL后混合）
b. 65°C孵育2min，打開RNA二級結(jié)構(gòu)，結(jié)束后迅速置于冰上。
c. 將200 uL混合液與100 uL洗滌后磁珠在室溫下旋轉(zhuǎn)混合3-5min。75ug Total RNA對應(yīng)1mg磁珠，磁珠應(yīng)預(yù)先洗滌并重分散在100 uL結(jié)合緩沖液中。
e. 室溫下分別用200 uL洗滌液B清洗磁珠，磁分離，去上清。重復(fù)該步驟1次。
f. 加入10～20μl 的10mM Tris-HCl，75~80°C孵育2min，然后快速將含有mRNA的上清液轉(zhuǎn)移到新的RNase-free的EP管。
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