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在生物樣本中，自發(fā)熒光是背景熒光的常見來源。 一種提高可檢測(cè)性的方法是使用時(shí)間分辨的發(fā)光試劑。 FluoBead-Eu熒光微球?qū)u3+摻入有機(jī)配位化合物中。 FluoBeads-Eu熒光微球的標(biāo)稱直徑為0.2 μm，可以不包衣或與鏈霉親和素結(jié)合使用。 鏈霉親和素蛋白標(biāo)記的珠子可用于許多基于生物素/親和素反應(yīng)的測(cè)定中的抗原和DNA靶標(biāo)的間接檢測(cè)。.
1. 產(chǎn)品特性
特 征
羧基修飾
鏈霉親和素修飾
名 稱
FluoBead-Eu-COOH
FluoBead-Eu-SA
組 成
聚苯乙烯
熒 光
銪螯合物
直 徑
0.2 μm
固含量
1 %
添加劑
0.05% NaN3
有效期
≥ 36 Mon
≥ 24 Mon
儲(chǔ) 存
不使用時(shí)請(qǐng)冷藏（2-8°C）產(chǎn)品，但不要凍結(jié)。 直立存放并保持瓶子密封。 請(qǐng)保存在原始的琥珀色瓶中，不要將其暴露在會(huì)使產(chǎn)品變質(zhì)的光線下。 用手或渦旋混合器輕輕顛倒混合產(chǎn)品。
注意：取用前，請(qǐng)先通過超聲處理，搖動(dòng)或渦旋混合均勻。在超聲處理之前，將鏈霉親和素標(biāo)記的微球等分。避免珠子過度渦旋/超聲處理，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)損壞。
基于鑭系元素螯合物（例如銪）的時(shí)間分辨熒光是最敏感的熒光。將銪螯合物摻入聚苯乙烯微球中為提供更高靈敏度的測(cè)定法提供了有效的手段。 銪螯合物的檢測(cè)下限降低，并且獲得的結(jié)果不受通常導(dǎo)致熒光干擾的因素的影響。使用直徑為0.2μm的羧基修飾或鏈霉親和素包被的FluoBead-Eu熒光微球，在基于顆粒的側(cè)向流動(dòng)分析中可實(shí)現(xiàn)高靈敏度。微球內(nèi)部用銪螯合物染色，具有寬的斯托克斯位移，在356 nm處激發(fā)，在613 nm處發(fā)射，并具有約0.5毫秒的超長壽命。這是大多數(shù)熒光團(tuán)的10,000到100,000倍。超長壽命使銪螯合物微球可廣泛用于時(shí)間分辨熒光，包括側(cè)流分析，核酸雜交，時(shí)間分辨熒光法和免疫/組織學(xué)研究。FluoBead-Eu熒光微球的使用比常規(guī)熒光團(tuán)的檢測(cè)極限降低了幾倍，因其具更高熒光強(qiáng)度并消除了相對(duì)短暫的基質(zhì)熒光的背景干擾。
? 羧基修飾或鏈霉親和素包被的熒光微球；
? 最大的顏色亮度和飽和度，可實(shí)現(xiàn)最佳的檢測(cè)靈敏度和可讀性；
? 封裝的染料可防止在水性介質(zhì)中浸出；
? 免疫球蛋白G有效吸附或共價(jià)偶聯(lián)以結(jié)合靶抗原；
? 銪螯合物具有較大的斯托克斯位移（激發(fā)在356 nm處激發(fā)，在613 nm處發(fā)射）。這提供了高靈敏度和低背景寬斯托克斯位移；
2. 抗體偶聯(lián)
2.1. 羧基熒光微球偶聯(lián)抗體
活化偶聯(lián)緩沖液
50 mM MES, pH 6.0.
EDC 溶液
200 mM EDC. （加 19.2 mg 的EDC 到 500 μL超純水）
Sulfo-NHS 溶液
200 mM Sulfo-NHS. （加 21.7mg的 Sulfo-NHS到 500 μL超純水）
封閉緩沖液
50 mM Tris, pH 8.0, 0.5% (w/v) casein (pH adjusted with 4 M HCl).
重要提示：請(qǐng)將熒光微球保持在黑暗中，即盡可能用鋁箔包裹離心管。每克微球偶聯(lián)60 mg抗體。
1. 將500μL熒光微球以1％（w / v）分裝到2 mL低蛋白結(jié)合管中。
2. 加入1 mL活化偶聯(lián)緩沖液并充分混合。
3. 以11,900×g離心7分鐘。
4. 倒出上清液，并將微球重懸于1 mL活化偶聯(lián)緩沖液中。上下吹打均勻混合，以免結(jié)塊可見。
5. 重復(fù)步驟3和4。
6. 最后一次洗滌后，將微球重懸于1 mL活化偶聯(lián)緩沖液中。
7. 超聲處理30秒鐘，確保微球不聚集。此時(shí)，可進(jìn)行目視檢查以確保微球不聚集。
注意：單個(gè)微球在400倍放大倍數(shù)下很難看到，并且會(huì)顯示為朦朧的顆粒海洋。但是，在400倍放大倍率下很容易觀察到聚集的微球。
8. 在使用前準(zhǔn)備新配EDC和Sulfo-NHS試劑。
9. 向1 mL洗滌過的微球（來自步驟7）中加入12μL的200 mM EDC和120μL的200 mM Sulfo-NHS。
10. 在室溫下振蕩混合30分鐘
11. 以11,900×g離心7分鐘。
12. 倒出上清液，并將微球重懸于1 mL活化偶聯(lián)緩沖液中–上下吹打均勻混合（將微球重懸后應(yīng)看不到團(tuán)塊）。
13. 重復(fù)步驟11和12。
14. 最后一次洗滌后，將微球重懸于850μL活化偶聯(lián)緩沖液中。
15. 將微球超聲處理30秒，以確保微球是單分散的（請(qǐng)參閱步驟7）。
16. 在活化偶聯(lián)緩沖液中制備濃度為2 mg / mL的檢測(cè)用抗體。
17. 基于每克微球60 mg抗體的包被濃度，向850μL微球中加入150μL的2 mg / mL抗體。徹底混合。現(xiàn)總體積為1 mL。
18. 在室溫下振蕩混合2.5小時(shí)。
19. 在通風(fēng)櫥中，向微球懸浮液中添加15μL乙醇胺。渦旋并振蕩混合30分鐘以淬滅任何剩余的活性位點(diǎn)。
20. 以11,900×g離心7分鐘。
21. 倒出上清液，并將微球重懸于1 mL封閉緩沖液中–上下吹打均勻混合，以使看不到團(tuán)塊。
22. 將微球超聲處理30秒，以確保微球是單分散的（請(qǐng)參閱步驟7）。
23. 在室溫下在振蕩混合過夜。
24. 以11,900×g離心7分鐘
25. 倒出上清液，并將微球重懸于1 mL封閉緩沖液中，并通過上下吸液徹底混合，以使看不到團(tuán)塊。
26. 重復(fù)步驟24和25。
27. 最后一次洗滌后，將微球重懸于0.5 mL封閉緩沖液中?，F(xiàn)在，微球的含量為1％（w / v）。儲(chǔ)存在4℃直到可以使用。
注意：請(qǐng)?jiān)?天內(nèi)使用。
2.2 鏈霉親和素?zé)晒馕⑶蚺悸?lián)抗體
1. 在使用前，將磁珠渦旋20秒。
2. 將50μL（0.5mg）鏈霉親和素?zé)晒馕⑶蚣尤? mL結(jié)合緩沖液（TBS-0.05％Tween 20清潔劑）中。用結(jié)合緩沖液洗滌微球兩次。
3. 將微球重懸于450 ul結(jié)合緩沖液中。
4. 將50μl血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清液添加到微球中。注意：根據(jù)用戶偏好修改樣品量。如果樣品體積小于500μL，則用結(jié)合緩沖液稀釋至最終體積500μL。
5. 振蕩混合30分鐘。
6. 以11,900×g離心7分鐘，并棄去上清液。用0.5ml結(jié)合緩沖液洗滌珠子兩次。
7. 最后一次洗滌后，將微球重懸于0.5 mL結(jié)合緩沖液中?，F(xiàn)在，微球的含量為1％（w / v）。儲(chǔ)存在4℃直到可以使用。
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