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1. 概述
PuriMagTM G-IA碘乙?；罨判约{米微粒是均一的、聚合物包覆的超順磁納米粒，親水表面確保磁珠在各種緩沖液中具有出色的分散性、低非特異吸附和易操作性，表面涂有高密度的碘乙?；倌軋F(tuán)。磁珠粒用于共價(jià)偶聯(lián)含巰基（-SH）的配體。
PuriMagTM G-IA碘乙?；罨判约{米微粒最適合結(jié)合較大的蛋白和小肽，因?yàn)橛H水性接頭可以減少空間位阻。隨后，可以高度嚴(yán)格地洗滌含有共價(jià)連接的蛋白質(zhì)的磁珠，實(shí)際上消除了任何非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。獨(dú)特的表面意味著在基于蛋白質(zhì)的系統(tǒng)中低的非特異性結(jié)合，并且無需使用表面活性劑即可實(shí)現(xiàn)出色的處理效果。這些高結(jié)合力的磁珠適合在各種研究和診斷應(yīng)用中使用，無論您是在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模還是對高通量應(yīng)用有更嚴(yán)格的要求。
特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)：
1）與半胱氨酸殘基共價(jià)和特異結(jié)合；
2）水不溶性配體可以在終濃度為10-30％的乙腈或二甲基甲酰胺（DMF）或二甲基亞砜（DMSO）的偶聯(lián)緩沖液中或在終濃度為6 M鹽酸胍的偶聯(lián)緩沖液中偶聯(lián)；
3）穩(wěn)定的共價(jià)鍵和低水平的配體泄漏；
4）產(chǎn)生可重復(fù)使用的免疫親和基質(zhì)；
5）低非特異性結(jié)合；
6）固定1~20 mg蛋白質(zhì)或0.1~2mg肽/ g磁珠
7.）應(yīng)用：抗體，蛋白質(zhì)/肽，DNA / RNA的純化；細(xì)胞分選，免疫沉淀
PuriMagTM碘乙酰磁珠偶聯(lián)巰基原理：
2. 產(chǎn)品信息
Product Specifications
Description
Polymer coated Fe3O4 nanoparticles
Particle Size
200 nm
Number of Beads
~1.7×1010 beads/mg
Matrix
Proprietary polymer
Functional group
Iodoacetyl groups
Group density
~300 μmole / g of Beads
Magnetization
60~70 EMU/g
Formulation
10mg/mL in in 1M NaCl and 0.02% NaN3
Stability
pH 3.5~10, 4~50 ℃, most organic solvents
Storage
1 year at 2~8 ℃. Do not freeze.
3. 使用方法
注意：以下方案是將蛋白或多肽與PuriMagTM G-IA碘乙酰基封端的磁珠偶聯(lián)的示例。強(qiáng)烈建議進(jìn)行滴定，以優(yōu)化用于每種單獨(dú)應(yīng)用的磁珠量。該協(xié)議可相應(yīng)地按比例放大和縮小。
A. 所需材料
1）磁力架（用于手動(dòng)操作）：用于容納12個(gè)單獨(dú)的1.5~2ml離心管（Mrack02）；用于容納2個(gè)50 ml離心管或2個(gè)15 ml離心管（目錄號Mrack03）
2）偶聯(lián)緩沖液
可溶性配體偶聯(lián)緩沖液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5；
不溶性配體偶聯(lián)緩沖液：50 mM Tris, 5 mM EDTA-Na, pH 8.5, 20- 30% DMSO or DMF or 6M guanidine?HCl
3）洗滌液： 1 M sodium chloride (NaCl) in distilled H2O
4）封閉化合物L(fēng)-Cysteine?HCl
5）TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine)
6）Phosphate buffered saline (PBS)
B. 樣品準(zhǔn)備
注意：
確保要結(jié)合的蛋白質(zhì)/肽具有游離的（還原的）巰基。為了確保可用的巰基游離基，必須使用DTT (dithiothreitol), TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine), or 2-MEA (2-Mercaptoethylamine?HCl) 等還原劑還原二硫鍵，然后進(jìn)行脫鹽或透析去除還原劑。
如果重新合成后立即使用新合成的肽，則可直接用于偶聯(lián)。
對于蛋白質(zhì)，在室溫下用5-10 mM TCEP溶液處理蛋白質(zhì)30分鐘，然后進(jìn)行透析或脫鹽柱。對于IgG抗體，建議使用2-MEA，因?yàn)槠溥x擇性減少了鉸鏈區(qū)二硫鍵。
如果樣品中含有帶有游離巰基的還原劑（例如2-巰基乙醇、DTT或TCEP），則必須通過透析或脫鹽將其徹底去除。
1）如果可溶，將1-10mg蛋白質(zhì)/肽溶解在1ml可溶性偶聯(lián)緩沖液中。如果不溶，則溶于1ml不溶性偶聯(lián)緩沖液中。
2）如果樣品已經(jīng)懸浮在其他緩沖液中，請用等體積的耦合緩沖液稀釋樣品。
C. PuriMagTM磁珠的準(zhǔn)備
1）稱重并將3 mg磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中。通過添加100 μl偶聯(lián)緩沖液重懸磁珠，并通過劇烈渦旋1~2分鐘混合磁珠。
注意：重新水合后，由于官能團(tuán)的穩(wěn)定性，應(yīng)盡快使用磁珠；將一些磁珠懸浮在緩沖液中后，可能會(huì)聚集，可以通過劇烈渦旋或非常溫和的超聲處理10~30秒將其完全懸浮。
2）磁分離，除去上清液。從磁力架移出離心管，并用1 ml偶聯(lián)緩沖液渦旋懸浮磁珠30秒鐘。
3）重復(fù)步驟2一次。
D. 偶聯(lián)
1）將B1或B2中的樣品添加到洗滌過的PuriMagTM磁珠中，并在室溫下輕輕旋轉(zhuǎn)孵育30-60分鐘。
2）如C2所述，用1ml偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠四次。
3）通過將磁珠懸浮在1ml偶聯(lián)緩沖液中（含8mg的Cysteine?HCl的），并在室溫下溫育30-60分鐘，以封閉磁珠上多余的活性基團(tuán)。
4）如C3所述，用1ml洗滌緩沖液洗滌PuriMagTM磁珠四次。
5）將磁珠重懸于含有0.05％疊氮化鈉的PBS緩沖液中，并儲存在4℃下。
E. 一般親和純化方案
注意：設(shè)計(jì)通用的純化DNA或RNA的方案相對簡單，因?yàn)楹怂岬纳匦韵鄬σ恢?。但是，設(shè)計(jì)一種通用的親和純化方案非常困難，因?yàn)槊糠N蛋白質(zhì)都有不同的組成和結(jié)構(gòu)。為了獲得最佳結(jié)果，每個(gè)用戶都必須為各個(gè)應(yīng)用程序確定最佳工作條件。
1）將最適量的PuriMagTM磁珠轉(zhuǎn)移到離心管中。磁分離1~3分鐘，除去上清液。
注意：強(qiáng)烈建議根據(jù)粗樣品中目標(biāo)蛋白的量進(jìn)行滴定，以優(yōu)化用于每種應(yīng)用的磁珠的量。所用磁珠過多會(huì)導(dǎo)致較高背景，而所用磁珠太少則會(huì)導(dǎo)致較低產(chǎn)量。每mg的磁珠通常結(jié)合1~20 ug的目標(biāo)蛋白。
2）取下離心管，用5倍磁珠體積的PBS緩沖液懸浮30秒。磁分離1~3分鐘，除去上清。
3）重復(fù)步驟2兩次
4）將洗滌過的PuriMagTM磁珠加入含有目標(biāo)蛋白的粗樣品中，并在室溫或所需溫度下孵育1~2小時(shí)（較低的溫度需要更長的孵育時(shí)間）。
5）用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl充分洗滌磁珠，直到280 nm洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280 <0.05）。
6）通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ疵撃繕?biāo)蛋白，例如低pH（2~4）、高pH（10~12）、高鹽、高溫、親和洗脫或在SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸。
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