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產(chǎn)品名稱
包裝
PMG-TagAb003-1mL
PuriMag? Anti-Flag Magnetic Beads （Anti-Flag磁珠）
1mL×1
PMG-TagAb003-5mL
1mL×5
保存條件： 4oC保存，至少三個(gè)月有效。長(zhǎng)期不使用，可以-20oC保存，-20oC可以保存更長(zhǎng)時(shí)間。
一．產(chǎn)品簡(jiǎn)介
2 PuriMag? Anti-Flag Magnetic Beads，即Anti-Flag磁珠，也稱Anti-Flag免疫磁珠或Flag抗體磁珠，是由高品質(zhì)的Flag小鼠單克隆抗體與納米級(jí)磁珠共價(jià)偶聯(lián)而成，可特異性地與動(dòng)植物或微生物裂解液、血清、腹水等中含有Flag標(biāo)簽的蛋白結(jié)合，從而用于帶有Flag標(biāo)簽的融合蛋白或其蛋白復(fù)合物的免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）、免疫共沉淀（Co-IP）或純化。
2 Flag標(biāo)簽（Flag-tag）、Myc標(biāo)簽（Myc-tag）、HA標(biāo)簽（HA-tag）、His標(biāo)簽（His-tag）和GST標(biāo)簽（GST-tag）等是表達(dá)載體上最常見的一些標(biāo)簽，通過與這些標(biāo)簽的融合表達(dá)可以非常方便地檢測(cè)目的蛋白及與目的蛋白相互結(jié)合的蛋白，也可以非常方便地用于目的蛋白的純化。
2 Flag-tag是8個(gè)氨基酸殘基（DYKDDDDK）組成的多肽，常用的形式有Flag和3×Flag，通過基因重組技術(shù)把Flag-tag的核酸序列與目的基因的5’端或3’端連接，就可最終表達(dá)形成Flag-tag的目的蛋白。Flag-tag具有以下優(yōu)點(diǎn)：Flag-tag通常不會(huì)與目的蛋白相互作用，并且大多數(shù)情況下不會(huì)影響目的蛋白的功能；Flag-tag作為標(biāo)簽蛋白，后續(xù)通過Flag抗體、Anti-Flag磁珠或Anti-Flag親和凝膠即可對(duì)目的基因的表達(dá)、定位及功能進(jìn)行檢測(cè)或?qū)δ康牡鞍走M(jìn)行純化、免疫沉淀或免疫共沉淀等；融合在N端的Flag標(biāo)簽，可被腸激酶（Enterokinase, EK）切除（DDDK），從而得到完美的沒有標(biāo)簽的目的蛋白?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，F(xiàn)lag標(biāo)簽已被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、相互作用和功能等多方面的研究。
2 PuriMag? Anti-Flag Magnetic Beads，也被稱為Anti-DYKDDDDK Magnetic Beads，可以特異性地結(jié)合Flag標(biāo)簽融合蛋白，并可以借助磁力架非常便捷地應(yīng)用于帶有Flag標(biāo)簽的融合蛋白或其蛋白復(fù)合物的免疫沉淀或純化等實(shí)驗(yàn)。
2 本產(chǎn)品特異性強(qiáng)、靶蛋白結(jié)合量高。與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)的同類產(chǎn)品相比，本產(chǎn)品抗體結(jié)合密度高，對(duì)帶有Flag標(biāo)簽蛋白的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性，并且本產(chǎn)品磁珠粒徑小，不易產(chǎn)生非特異吸附。本產(chǎn)品懸液含約10mg磁珠/mL，含有不少于0.6mg Flag抗體，通?？山Y(jié)合不少于0.6mg Flag標(biāo)簽融合蛋白，具體的最大結(jié)合量和標(biāo)簽蛋白的分子量大小等相關(guān)。每500微升樣品，通常僅需使用10-20 μL磁珠懸液，就可高效地進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)。
2 本產(chǎn)品可結(jié)合多種形式的Flag標(biāo)簽蛋白。本產(chǎn)品可特異性地結(jié)合甲硫氨酸修飾的N端Flag融合蛋白（Met-Flag-Protein）、N端Flag融合蛋白（Flag-Protein）、C端Flag融合蛋白（Protein-Flag）。
2 本產(chǎn)品結(jié)合目的蛋白速度快。本產(chǎn)品使用了~200nm納米級(jí)磁珠，具有超大的比表面積，便于抗體和抗原的快速有效結(jié)合。通常10 min內(nèi)即可完成抗原吸附的過程，30 min內(nèi)完成目的蛋白免疫沉淀操作?？s短操作時(shí)間可以有效避免在長(zhǎng)時(shí)間操作過程中目的蛋白的降解或變性，充分保證目的蛋白的活性。
2 本產(chǎn)品可選擇多種洗脫方法。本產(chǎn)品可以根據(jù)目的蛋白的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能及后續(xù)應(yīng)用的要求等，使用多種洗脫方法，包括Flag多肽、酸性和SDS-PAGE上樣緩沖液等洗脫液進(jìn)行洗脫。特別是Flag多肽洗脫后不會(huì)包含抗體的輕鏈和重鏈，可以有效解決免疫沉淀后Western實(shí)驗(yàn)中輕鏈和重鏈的干擾問題。本產(chǎn)品用于GFP-Flag融合蛋白的免疫沉淀效果參考圖1。
二．主要技術(shù)指標(biāo)
Product content
10mg/ml magnetic beads in specific protective buffer
Beads size
~200nm
Magnetization
Superparamagnetic
Coupled antibody
Anti-Flag mouse monoclonal antibody
Isotype
IgG2b
M.W. of antibody
Approximately 150kDa
Antibody concentration
≥ 0.6mg Flag antibody per ml beads
Binding capacity
≥ 0.6mg Flag‐tagged fusion protein per ml beads
Specificity
Met-Flag-Protein, Flag-Protein, Protein-Flag
Elution method
Acid, peptide competitive or SDS‐PAGE loading buffer elution. Note: If elute with SDS-PAGE loading buffer, the light (~25kDa) and heavy (~50kDa) chain of Flag antibody will be denatured and release from the beads.
Application
IP, Co-IP, Protein purification
三．注意事項(xiàng)
l 本產(chǎn)品經(jīng)測(cè)試，反復(fù)凍融3次以上，不影響使用效果。
l 本產(chǎn)品需維持pH為6-8，避免高速離心和干燥；請(qǐng)勿長(zhǎng)時(shí)間置磁珠于磁場(chǎng)中，否則可能會(huì)引起磁珠聚團(tuán)。
l 本產(chǎn)品使用前要適當(dāng)充分重懸，混勻操作須輕柔，不宜劇烈渦旋震蕩等，避免抗體變性等。
l 在免疫沉淀或純化時(shí)，建議設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照組。
l 蛋白樣品收集后宜盡快完成純化工作，并應(yīng)始終放置在4oC或冰浴，以減緩蛋白降解或變性。為有效抑制蛋白降解，可以在蛋白樣品中添加適量的蛋白酶抑制劑混合物。
l 如果使用真空泵等儀器吸取上清液，須注意真空泵的吸液強(qiáng)度，以免吸力過大而吸取到聚集的磁珠。
l 酸性溶液洗脫時(shí)磁珠可能會(huì)發(fā)生聚集，屬于正?，F(xiàn)象，不影響磁珠的正常使用。0.1%的非離子型去垢劑（如Triton X-100、Tween-20或NP-40）可有效防止磁珠聚集，并且不會(huì)影響磁珠的抗體結(jié)合效率。
l 高濃度的DTT、巰基乙醇、鹽酸胍等對(duì)本產(chǎn)品與標(biāo)簽蛋白的結(jié)合可能有一定影響，但Western及IP細(xì)胞裂解液、RIPA裂解液或NP-40裂解液等都完全適用。
l 本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員科研使用。 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
四．使用說明
1. 樣品的制備
a. 選擇合適的裂解液，用于制備細(xì)胞或組織的裂解液。如果使用自行配制的或其它公司生產(chǎn)的裂解液，需要確保裂解液的pH為6-8。
b. 具體的細(xì)胞或組織樣品裂解的制備步驟請(qǐng)參考裂解液的使用說明。制備好的裂解液上清宜置于冰上或4oC存放，隨后即可用于免疫沉淀或免疫共沉淀、標(biāo)簽蛋白的純化等操作。新鮮制備好的樣品，建議盡量當(dāng)天完成免疫沉淀等后續(xù)操作，但如果樣品不能當(dāng)天使用，也可以適當(dāng)分裝后-80oC凍存。
2. Anti-Flag磁珠的準(zhǔn)備
由于Anti-Flag磁珠儲(chǔ)存在特殊保護(hù)液中，所以需要在加入樣品前適當(dāng)洗滌。
a. 用移液器輕輕吹打重懸Anti-Flag磁珠，按照每500μl樣品10μl或20μl磁珠懸濁液，取適量Anti-Flag磁珠至一潔凈離心管中，加入1×TBS至最終體積為約0.5ml。
b. 用移液器輕輕吹打并充分重懸Anti-Flag磁珠。置于磁力架上分離10秒，去除上清。重復(fù)上述步驟兩次。
c. 按照初始體積的量，用1×TBS重懸Anti-Flag磁珠。
3. 免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）
a. 加入磁珠與孵育。按照每500μl蛋白樣品加入10μl或20μl磁珠懸濁液的比例加入Anti-Flag磁珠，置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育2小時(shí)或4oC孵育過夜。注：孵育過程中，如果磁珠發(fā)生聚團(tuán)或呈片狀屬正?，F(xiàn)象，不會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
b. 磁分離。孵育完畢后，磁分離，去除上清。注：可保留部分上清液，用于檢測(cè)免疫沉淀的效果。
c. 洗滌。加入500μl的1×TBS，用移液器輕輕吹打重懸Anti-Flag磁珠。磁分離，去除上清。重復(fù)洗滌三次。注：也可以通過檢測(cè)洗滌得到的洗滌液的OD280來(lái)判斷是否洗滌完全，若OD280大于0.05，應(yīng)適當(dāng)增加洗滌次數(shù)。
4. 洗脫
根據(jù)標(biāo)簽蛋白的特點(diǎn)及后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，可以選擇如下3種方法之一進(jìn)行洗脫。
a. 3×Flag競(jìng)爭(zhēng)洗脫法：本方法為非變性法，洗脫效率高，且洗脫后的蛋白保持原有的生物活性，便于后續(xù)分析檢測(cè)。
(a) 3×Flag多肽洗脫液的配制：取適量3×Flag多肽溶解于1×TBS中，使其終濃度為150μg/ml，或稀釋5mg/ml的3×Flag多肽溶液至150μg/ml。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積，加入100μl 3×Flag多肽洗脫液（150μg/ml），混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫?fù)u晃孵育30-60分鐘，或4oC孵育1-2小時(shí)。為了提高洗脫效率，可延長(zhǎng)孵育時(shí)間或重復(fù)洗脫。
(c) 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。上清即為洗脫的Flag標(biāo)簽蛋白。
(d) 洗脫的Flag標(biāo)簽蛋白置于4oC待用，或者-20oC或-80oC長(zhǎng)期保存。
b. 酸性洗脫法：本法為非變性法，比較快速且高效。洗脫后的蛋白保持原有的生物活性，便于后續(xù)分析檢測(cè)。
(a) 溶液的配制：酸性洗脫液（0.1M Glycine-HCl, pH3.0），中和液（0.5M Tris-HCl, pH7.4, 1.5M NaCl）。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積，加入100μl酸性洗脫液，混勻后置于側(cè)擺搖床或旋轉(zhuǎn)混合儀上，室溫孵育5分鐘。注：孵育時(shí)間不宜超過15分鐘。
(c) 孵育完畢后，置于磁力架上分離10秒，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并立刻加入10μl中和液，適當(dāng)混勻。
(d) 為了獲得最大的洗脫效率，可重復(fù)步驟b和c，并將相同樣品合并。
(e) 洗脫并中和的Flag標(biāo)簽蛋白置于4oC待用，或者-20oC或-80oC長(zhǎng)期保存。
注1：酸性洗脫法雖然高效，但仍可能低于競(jìng)爭(zhēng)洗脫法或SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫法。
注2：由于目的蛋白的差異可能對(duì)酸性洗脫法的洗脫效率有一定的影響，如果對(duì)洗脫效率的要求比較高，可對(duì)酸性洗脫液的pH在2.5-3.1之間進(jìn)行一定的調(diào)整，相應(yīng)的中和液的pH值或量也要進(jìn)行一定的調(diào)整，例如100μl酸性洗脫液（0.1M Glycine-HCl, pH2.8）和15μl中和液（1M Tris-HCl, pH8.5）。
c. SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫法：本方法為變性法，得到的蛋白樣品適合SDS-PAGE電泳或WB檢測(cè)。
(a) SDS-PAGE上樣緩沖液的配制：參考《分子克隆》等配制5×或2×的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，然后加入水配制成1×的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。通常SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液含有DTT等還原劑，其洗脫得到的蛋白樣品中會(huì)含有Flag抗體的輕鏈和重鏈。
(b) 每10-20μl原始磁珠體積的磁珠，加入100μl 1× SDS-PAGE上樣緩沖液，95oC加熱5分鐘。
(c) 置于磁力架上分離10秒，取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳或Western檢測(cè)。
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