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3 臨床糖蛋白質組學與人類疾病

       臨床糖蛋白質組學方法的進步顯著增強了其在廣泛疾病中的應用。這包括腦部疾病、心血管疾?。–VDs）、癌癥、腎臟疾病和代謝性疾病。這些創(chuàng)新為理解疾病機制、改進診斷和定制個性化治療策略提供了有希望的途徑。在此，我們旨在全面回顧和討論糖蛋白在疾病機制中的作用，突出其在診斷和治療干預中的重要性。通過這樣做，我們希望為未來的臨床糖蛋白質組學研究提供更清晰的方向，潛在地為疾病管理和治療策略的突破性發(fā)現鋪平道路。

3.1 腦部疾病

3.1.1 阿爾茨海默病

      根據流行病學數據，到2050年，全球患阿爾茨海默?。ˋD）的風險人群預計將翻倍。AD的發(fā)展涉及三個主要階段（圖3）。最初，與微管相關的單元（Tau）蛋白在高爾基體內發(fā)生糖基化，導致它們在神經元中的積累。這一過程隨后是淀粉樣β斑塊的產生和神經纖維纏結的形成。這些病理變化最終導致神經元丟失和退化，促成了與AD相關的認知障礙。淀粉樣β蛋白的積累，主要由遺傳變異如載脂蛋白E（APOE）引起，以及由Tau觸發(fā)的神經纖維纏結的存在，代表了與AD相關的重大病理生理變化。近期的臨床糖蛋白質組技術進展揭示了這些復雜的糖蛋白質組相互作用參與了AD的發(fā)病機制。例如，Zhang等人通過ZIC-HILIC和LC-MS/MS技術鑒定了與AD表型相關的六種N-糖蛋白。這些糖蛋白影響細胞外基質、突觸和細胞器的功能，以及神經炎癥、細胞粘附和內吞運輸。同年，AD（APP/PS1轉基因）小鼠大腦中的N-糖蛋白質組景觀揭示了谷氨酸受體的失調，以及巖藻糖基化和寡糖基化糖鏈。Suttapitugsakul等人分析了正常、無癥狀和有癥狀AD人腦中的N-糖蛋白。他們的發(fā)現揭示了大腦主要含有高甘露糖、巖藻糖基化和雙切N-糖鏈，通過多凝集素富集、HILIC和LC-MS/MS技術觀察到不同AD階段的獨特表達模式。這些研究揭示了N-糖基化在AD發(fā)病機制中的多方面作用，為解釋AD患者腦脊液中的循環(huán)糖蛋白及其潛在的診斷價值提供了寶貴的見解。此外，Losev等人對野生型人Tau的N-糖基化進行了深入研究。他們的分析揭示了N359和N410位置的天冬酰胺殘基發(fā)生了N-糖基化。然而，當天冬酰胺被谷氨酰胺替代時，這種N-糖基化在突變體中是缺失的。此外，CSF中中間雙切GlcNAc與Tau比率的患者被發(fā)現有更高的AD風險，風險比為2.06，95%置信區(qū)間（CI）為1.18-3.6。

      同樣，另一項研究發(fā)現32個N-糖位點被雙切GlcNAc修飾。這種修飾由乙酰葡萄糖胺轉移酶-III催化，涉及通過β-1,4-連接將GlcNAc轉移到N-糖鏈的甘露糖上，這加劇了AD的發(fā)病。相比之下，二氫麥角克堿甲磺酸鹽已被證明可以通過減輕異常的雙切N-糖基化來緩解空間記憶障礙和阿爾茨海默病型變化。神經炎癥被廣泛認為是AD發(fā)病機制中的一個核心組成部分。因此，免疫糖蛋白可能作為精確檢測AD的潛在生物標志物。例如，自然產生的自身抗體用于防御淀粉樣β蛋白。最近的一項研究通過MALDI-TOF-MS分析了AD自身抗體的糖鏈結構。結果表明，N-糖基化在聚集、毒性和吞噬作用中發(fā)揮重要作用，預測疾病狀態(tài)的特異性和敏感性分別可達100%和95%。同時，O-糖基化也影響AD的發(fā)病。以前的研究表明，淀粉樣β蛋白，作為淀粉樣前體蛋白（APP）的一個片段，是病理性老年斑塊的重要成分。然而，切割位點的O-糖基化影響淀粉樣蛋白的合成和產生，這無疑影響AD的進展。在2022年，開發(fā)了一個綜合平臺，結合了通用的水楊酸硼酸富集、高pH分級和EThcD方法，為AD患者和健康個體提供了O-糖基化的無偏輪廓。總共鑒定了308個O-糖肽，包括唾液酸化和非唾液酸化形式。此外，巖藻糖基化減少和內源性O-糖基化增加的趨勢可能有助于AD的進展。此外，Shi等人開發(fā)了一種使用多片段技術的靶向MS方法來識別O-糖位點。在APP上鑒定了14個O-糖位點，其中至少有四個O-糖位點含有N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）（Tn抗原）、核心1和單或雙唾液酸化的核心。APP的超O-糖基化形式更容易降解成淀粉樣β蛋白。在受AD影響的神經元中，低O-糖基化的APP被運輸回高爾基體，在那里它獲得額外的O-糖鏈。這種不典型的O-糖基化途徑允許超O-糖基化的APP有助于淀粉樣β蛋白的病理產生，表明其作為診斷和治療靶點的潛力。Krüger等人144最初報告了一種通過分析CSF中的游離糖鏈來區(qū)分AD的方法。這些發(fā)現表明，當N-和O-糖鏈或單糖完全占據時，唾液酸化糖基化比O-糖基化更普遍。他們還展示了一些糖鏈能夠有效區(qū)分AD患者和健康對照組。此外，鑒定了一類新的化合物，能夠抑制去O-糖基化，顯示出緩解AD癥狀的潛力。通過靶向OGlcNAcase（OGA），一種負責溶解O-糖鏈的關鍵酶，抑制了人類OGA和HexB的活性。這種抑制為開發(fā)有效的抗Tau磷酸化劑治療AD提供了希望。

圖3：阿爾茲海默病發(fā)病過程中的糖蛋白變化。

3.1.2 其他神經系統疾病

      其他神經系統疾病，包括神經退行性疾病、神經精神疾病和神經發(fā)育疾病，受糖蛋白的影響程度不同。由于新型糖蛋白質組技術的發(fā)展，研究人員已經開始更深入地探索這些影響。像AD一樣，帕金森?。≒D）是一種受糖蛋白影響的神經退行性疾??；然而，支持這種關系的證據有限。最近的一項N-糖蛋白質組學研究揭示了與PD相關的蛋白質的總糖鏈水平和特定糖位點的核心巖藻糖、唾液酸和雙切GlcNAc的增加。在神經精神疾病的背景下，已在精神分裂癥患者的大腦中研究了γ-氨基丁酸受體（α1、β1和β2）的異常N-糖基化，表明N-糖基化的變化可能有助于非典型的神經情感。146最近的一項研究揭示了溶質載體家族39成員8（SLC39A8）基因中的錯義變異與N-糖基化強烈相關。147純合子功能喪失突變在SLC39A8中導致血漿錳（Mn）水平下降。重要的是，由于Mn在N-糖鏈生物合成中的關鍵作用，N-糖基化的分析顯示前體N-糖鏈的增加以及復雜N-糖鏈的減少。此外，全基因組關聯研究（GWASs）表明，參與O-糖基化的基因有助于精神分裂癥的發(fā)病機制。例如，多肽N-乙酰半乳糖胺基轉移酶10可以影響大腦中的糖基化酶，并已被確定與精神分裂癥有強烈的聯系。當糖基化與神經發(fā)育疾病相關時，相關發(fā)現顯著較少。最近的一項研究揭示了X染色體連鎖的神經配對素4（NLGN4）的異常N-糖基化與自閉癥譜系障礙的發(fā)展相關。NLGN4中的突變破壞了相鄰N102糖位點的N-糖基化，損害了表面運輸和正常的突觸功能。150雷特綜合征，被認為是自閉癥譜系障礙的一個子集，主要歸因于甲基-CpG結合蛋白2（MECP2）基因的突變。特別是，在MECP2基因的突變中發(fā)現O-GlcNAcylation在蘇氨酸203的缺陷會干擾培養(yǎng)細胞和鼠標模型皮層中的突觸傳遞，導致各種功能障礙。事實上，越來越多的證據表明異常糖基化與腦部疾病之間存在聯系。然而，特定糖基化模式與個別疾病之間的確切關系仍不清楚。影響思維、行為和發(fā)展的因素是復雜的，需要進一步調查。

3.2 心血管疾病

      糖蛋白在心肌細胞和血管內皮細胞的形成和調節(jié)中起著基本作用，使它們能夠執(zhí)行生理功能、維持代謝和保持穩(wěn)態(tài)。相反，異常的糖基化可能導致心血管疾病的發(fā)展。當前的研究主要集中在識別異常的糖基化過程和模式，旨在闡明異常糖基化與外部病理表現之間的內在聯系，特別是在動脈粥樣硬化（AS）、心力衰竭（HF）和缺血性心臟?。↖HD）的背景下，將在下面詳細討論（圖4）。最后，我們總結和討論了心血管疾病糖蛋白質組學研究的進展以及現有的局限性。

3.2.1 動脈粥樣硬化

      AS的傳統機制包括三個主要階段：脂肪條紋的形成、粥瘤和動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展，這些都伴隨著炎癥（圖4）。在血管內皮細胞的內膜空間中，氧化低密度脂蛋白（OxLDL）、巨噬細胞（特別是泡沫細胞）、平滑肌細胞（SMCs）和細胞碎片的積累，將導致血管腔狹窄，甚至血管閉塞和心肌梗死（MI）。目前，隨著低密度脂蛋白（LDL）水平、吸煙率和血壓的降低，風險因素的輪廓在一定程度上發(fā)生了變化，伴隨著年輕AS患者的增加。這一新發(fā)現也將炎癥途徑與AS的進展聯系起來。隨著生物標志物檢測技術的進步，人們不僅關注LDL，還關注免疫過程和細胞相互作用。通過清晰和系統地闡明AS的機制，精確的診斷和治療在未來變得可行。糖鏈和糖鏈結合蛋白在疾病發(fā)展中起著至關重要的作用。內皮蛋白多糖和細胞結合的糖蛋白以及糖脂質是防止血漿成分與內皮細胞相互作用并破壞其完整性的屏障，同時也是GAG結合蛋白的庫。此外，AS顯著受到高脂血癥的影響，特別是甘油三酯和膽固醇水平的升高，這與載脂蛋白和脂蛋白密切相關。161,162因此，這些蛋白質的糖基化可以影響AS的進展。值得注意的是，大多數與高密度脂蛋白（HDL）和LDL相關的蛋白質都經歷了糖基化。在一項比較研究中，分析了因冠狀動脈AS導致的心肌梗死患者與健康個體的血脂譜和糖基化脂蛋白，研究人員報告說，患者的血清中糖基化血紅蛋白（G-HbA1c）、糖基化HDL（G-HDL）和糖基化LDL（G-LDL）的水平顯著增加。此外，發(fā)現G-LDL的水平與血糖水平和HbA1c顯著相關。如前所述，炎癥對AS的進展至關重要。P選擇素糖蛋白配體1（PSGL1）不僅作為一種跨膜糖蛋白，而且作為單核細胞上的一個重要的選擇素配體。全基因組關聯研究（GWASs）表明，多肽N-乙酰半乳糖胺基轉移酶4（GALNT4）可能與AS的易感性相關。更重要的是，GALNT4的表達可以修改PSGL1的O-糖基化，隨后激活下游信號分子，如Akt/mTOR和IκBα/NFκB，這增強了單核細胞的粘附和遷移。166這一糖基化過程在單核細胞的募集中起著至關重要的作用，以及在粘附分子和泡沫細胞膜蛋白的功能中，這些都有助于AS的進展。

      最近的發(fā)現強調了各種糖蛋白在疾病進展中的關鍵作用。糖蛋白VI（GPVI）被認為是評估與AS早期階段相關的凝血水平的重要標志物，例如血小板粘附。GPVI的存在量越高，表明血小板激活的可能性越大。這種相關性強調了GPVI在AS的早期檢測和管理中的重要性。一項基礎研究表明，通過給予抗GPVI抗體來抑制GPVI，可能會減慢或停止AS的進展。此外，關于從人類動脈粥樣硬化斑塊中提取的β2糖蛋白I（β2GPI）的有趣發(fā)現。這項研究揭示了斑塊內的免疫反應，揭示了在富含β2GPI的區(qū)域中CD4(+)淋巴細胞的主要浸潤，而CD8(+)淋巴細胞顯著缺失。對β2GPI的不同淋巴細胞亞型的存在差異突出了免疫系統與動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展之間的復雜相互作用。總之，OxLDL的形成和巨噬細胞的激活是AS發(fā)展的重要因素。糖基化在這一過程中廣泛參與，影響糖蛋白的結構和功能，并導致病理變化。因此，闡明AS發(fā)展過程中糖基化模式的異常不僅增強了我們對潛在機制的理解，還為患者提供了潛在的新治療靶點。

3.2.2 心力衰竭

      心力衰竭已成為全球重要的流行病，其特點是高死亡率，尤其是在老年人口中。作為一種進展性疾病，心力衰竭主要涉及心肌損傷和心肌的異常收縮性。與心力衰竭相關的病理和生理變化可以歸因于神經激素因素的變化，如β-腎上腺素激素、血管緊張素和內皮素，以及左心室心肌的重構。最近的臨床研究表明，鈉-葡萄糖共轉運體2（SGLT2）抑制劑在治療糖尿病時不僅降低了血糖水平，還減少了心血管疾病的發(fā)生率。研究已經證明SGLT2在調節(jié)酮體、碳水化合物和脂肪酸中起著關鍵作用，這對于心肌代謝至關重要，包括離子穩(wěn)態(tài)和細胞氧化還原反應。此外，一些研究人員建議心力衰竭的發(fā)作可能與微量營養(yǎng)素的缺乏有關，這些微量營養(yǎng)素對于線粒體代謝至關重要，如鐵、硒和鋅。

      Basigin（CD147），也稱為細胞外基質金屬蛋白酶（MMP）誘導劑，是一種跨膜糖蛋白，在MMP的合成中起著關鍵作用。這些酶在多種生化過程中是不可或缺的，包括心肌組織的重構。最近的一項研究發(fā)現，糖基化的CD147是心臟組織中的主要形式，并且在小鼠模型中對橫向主動脈收縮（TAC）的反應中顯著上調。此外，通過腺相關病毒9誘導心臟特異性過表達野生型CD147或帶有三個改變糖位點的突變型CD147，揭示了重要的見解。接受野生型CD147注射的小鼠在TAC后心臟功能顯著惡化，影響了心肌收縮和舒張。病理檢查表明存在心肌肥大，特征是心肌細胞的橫截面積增加和心肌纖維化，以及心房利鈉肽和腦利鈉肽等肥大標志物的水平升高。相比之下，表達特異性糖基化CD147的小鼠心臟功能得到改善，表明糖基化減輕了CD147過表達相關的有害效應。此外，CD147的基序分析呈現了與腫瘤壞死因子受體相關因子2（TRAF2）的潛在結合位點，以前與心臟功能障礙有關。免疫共沉淀研究表明，野生型CD147與TRAF2相互作用，而糖基化CD147與TRAF2的結合親和力顯著降低。因此，糖基化CD147為心力衰竭的治療提供了新的視角。156在2022年，一種名為stachytine鹽酸鹽的藥物被用來抑制N-糖基化中β1腎上腺素受體（β1AR）的α-1,6-巖藻糖基化，在小鼠研究中。β1AR的激活促進了其與G蛋白的結合，隨后增強了環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的合成。這一過程激活了蛋白激酶A（PKA）及其下游信號分子，最終導致心肌收縮力的增加。183LCA方法驗證了stachytine鹽酸鹽通過降低α-1,6-巖藻糖基轉移酶（FUT8）和α-1,3-巖藻糖基化蛋白4-β-N-乙酰葡萄糖胺轉移酶A的活性，并增加β1AR上的N-糖基化，維持cAMP/PKA信號通路的激活以保護心肌細胞。184此外，MS被用來研究心力衰竭小鼠血清和組織中異常豐富的糖蛋白。發(fā)現小鼠能夠合成N-乙酰神經氨酸（NeuAc）。然而，這種化合物主要存在于血清中，這與TAC的機制一致。

      總的來說，心力衰竭中的糖蛋白質組學發(fā)現顯著增強了我們對這種疾病機制的理解（圖4）。重要的是，闡明關鍵糖蛋白的豐度和質量，以及建立心力衰竭患者和健康對照之間的標準化比較，對于有效的預防、診斷和治療至關重要。當前的研究傾向于將異常糖基化的炎癥因子與心力衰竭的機制聯系起來。未來的研究應該探索抗炎策略和心肌細胞代謝的調節(jié)，以潛在地減緩甚至逆轉心臟重構。

3.2.3 缺血性心臟病

      全球缺血性心臟病（IHD）的發(fā)病率正在上升，導致心肌梗死的發(fā)生率增加，這與高死亡率有關，尤其是在女性中。研究人員認為，IHD背后的基本機制涉及動脈粥樣硬化的動態(tài)過程或冠狀動脈循環(huán)的改變，導致心臟血流減少，最終導致心肌氧氣供應不足。在這個動態(tài)過程中，各種生物標志物，包括心肌肌鈣蛋白、微小RNA和全身炎癥指數，從細胞釋放到血液中。這些生物標志物在預防和診斷IHD中起著重要作用。下面，我們詳細討論與IHD相關的某些糖蛋白生物標志物。一項多中心隊列研究表明，載脂蛋白J（ApoJ）是一種細胞保護性和抗氧化糖蛋白，在心肌缺血期間顯著誘導，并且糖基化ApoJ（ApoJ-Glyc）的水平降低。在經皮干預后，觀察到ApoJ-Glyc水平的增加，表明ApoJ-Glyc可能作為早期診斷的新生物標志物。雖然全面討論與IHD相關的改變很重要，但同樣重要的是關注IHD的結果，如急性心肌梗死（AMI）和心肌缺血-再灌注（I/R）損傷。分析AMI中載脂蛋白A-I（Apo A-I）的特定N-糖基化和O-糖基化的研究揭示了45-kDa Apo A-I的變化與N-糖基化相關，而28-kDa Apo A-I的變化與O-糖基化相關。在心肌I/R損傷的過程中，心肌線粒體代謝相關糖蛋白發(fā)生變化。利用LC-MS/MS和生物信息學分析建立大鼠心肌I/R損傷模型的研究揭示了多種糖蛋白的變化，包括GalNAcα/β1-3/6 Gal、GalNAcα1,3 Gal和GalNAcα-1和3Galβ-1，與假手術組相比有顯著差異。值得注意的是，被桑椹黑果凝集素（SNA）識別的Siaα2-6 Gal/GalNAc結構的數量顯著增加。與AS和HF相關的發(fā)現相比，與IHD相關的糖蛋白質組學發(fā)現在臨床診斷中仍然不足。一個原因是IHD通常與AMI同時診斷，這在很大程度上依賴于臨床表現和心電圖結果。然而，AMI的發(fā)生與高死亡率強烈相關。因此，識別與IHD相關的生物標志物并促進早期診斷和預防是降低AMI風險的關鍵步驟?？傊?，大量研究表明糖蛋白在調節(jié)心血管系統功能中起著關鍵作用，而異常糖基化可能導致心血管疾病。盡管我們強調了心血管疾病中糖基化的重要性，但必須認識到我們目前的理解仍然有限，特別是關于心血管疾病背后的詳細機制。此外，從癌癥和自身免疫疾病領域獲得的見解中，當代研究傾向于關注與心血管疾病相關的炎癥因子及其異常糖基化模式。鑒于心血管疾病中涉及的細胞類型多樣，使用單細胞技術研究蛋白質糖基化可能會帶來巨大的好處。最后，探索細胞相互作用對于深入理解心血管疾病的發(fā)生和進展至關重要。然而，當前的研究主要集中在闡明不同類型血管內皮細胞之間的變化，而不是系統地描述參與循環(huán)系統代謝的細胞之間的相互作用，并將這些相互作用與特定的病理生理變化聯系起來。未來，糖蛋白質組學的進步預計將帶來新的發(fā)現，這將顯著增強心血管疾病的臨床預防、診斷和治療。

圖4：心血管疾病的病理生理學與糖蛋白的異常變化