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Differences in Protein Capture by SP3 and SP4 Demonstrate Mechanistic Insights of Proteomics Cleanup Techniques, 
Jessica M. Conforti, Amanda M. Ziegler, Charli S. Worth, Adhwaitha M. Nambiar, Jacob T. Bailey, Joseph H. Taube, and Elyssia S. Gallagher
Journal of Proteome Research 2024 23 (9), 3877-3889
DOI: 10.1021/acs.jproteome.4c00206

摘要：蛋白質組學實驗的目標是鑒定蛋白質以觀察細胞過程和疾病的變化。蛋白質組學的一個挑戰(zhàn)是蛋白質提取后去除污染物，這可能會限制蛋白質鑒定。SP3增強樣品制備是一種凈化技術，其中蛋白質通過親水相互作用液相色譜 （HILIC） 類似機制捕獲在羧基修飾的顆粒上。最近的結果表明，由于蛋白質聚集機制，蛋白質被捕獲在 SP3 中。SP4是一種新的凈化技術，它采用蛋白質沉淀聚集來捕獲蛋白質，而無需修飾顆粒。我們假設 SP3 和 SP4 捕獲機制的差異會影響每種凈化技術鑒定的蛋白質。在此，我們評估了使用 SP3 與 SP4 鑒定和富集的 MCF7 亞細胞組分的蛋白質，并將每種方法中的蛋白質捕獲與蛋白質疏水性相關聯。我們的結果表明，SP3 通過 類HILIC和蛋白質聚集機制的組合捕獲更多的親水性蛋白質，而 SP4 通過蛋白質聚集機制捕獲更多的疏水性蛋白質。最終，我們證明了蛋白質捕獲機制是不同的，并且選擇產生高蛋白質組覆蓋率的純化技術取決于蛋白質-樣品的疏水性。SP3磁珠請參考http://m.5000js.com/Product/1736805216.html。

介紹

蛋白質組學實驗的一個關鍵目標是鑒定生物樣品中的蛋白質，以揭示調節(jié)細胞活性的疾病生物標志物和翻譯后修飾。因此，蛋白質組學實驗需要檢測和鑒定具有不同特性且以不同濃度存在于生物樣品中的蛋白質。通常，蛋白質組學工作流程包括蛋白質提取、二硫鍵還原、游離半胱氨酸烷基化、樣品凈化、蛋白質消化、液相色譜-串聯質譜 （LC-MS/MS） 和數據庫搜索。在蛋白質提取過程中，緩沖液、鹽和離液劑等污染物會破壞細胞膜以釋放和溶解蛋白質，同時保持生理 pH 值以避免蛋白質沉淀。雖然這些污染物對于蛋白質提取是必需的，但在電噴霧過程中會抑制消化酶活性、LC 分離度和肽電離，從而減少鑒定出的蛋白質數量。

盡管在蛋白質消解之前必須有效去除蛋白質提取產生的污染物，但樣品凈化仍然是蛋白質組學工作流程中的一個限制。SP3是一種凈化技術，與基于過濾器的方法相比，能夠鑒定更多的肽和蛋白質，具有更高的試驗間重現性。SP3 使用有機變性溶劑誘導蛋白質與羧基磁珠結合。引入該技術后，有人提出蛋白質基于類親水相互作用液相色譜 （HILIC）機制與顆粒相互作用。使用外部磁鐵，將蛋白質結合的顆粒吸引到微量離心管的側面，從而在蛋白質消化之前去除上清液中的污染物。然而，羧基磁珠可以 （1） 不充分結合蛋白質，導致殘留在上清液中的蛋白質丟失;（2） 通過與蛋白酶抑制劑結合來破壞消化效率;（3） 不可逆地結合蛋白質，防止它們被帶入 LC-MS/MS; （4） 如果攜帶到儀器中，會堵塞 LC 色譜柱。

SP3 的蛋白質捕獲機制最近受到挑戰(zhàn)，表明 SP3 主要通過蛋白質聚集機制捕獲蛋白質，而不是 HILIC 樣機制。SP4采用提出的這種蛋白質聚集機制，省略了磁性羧酸鹽修飾的顆粒。在 SP4 中，使用有機溶劑沉淀和聚集蛋白質，使蛋白質能夠通過離心沉淀。有問題的污染物留在上清液中去除，產生用于消化的聚集蛋白沉淀。與 SP3 相比，SP4 以前能夠鑒定 HEK293、Jurkat 人永生化 T 和 E14 小鼠胚胎干細胞裂解物的相似或更多數量的肽和蛋白質。對于 HEK293 裂解物，與 SP3 相比，SP4 還富集了低溶解度跨膜蛋白的回收率。 蛋白質捕獲的這種差異可能是由于 SP3 中使用的羧酸鹽修飾顆粒。因此，我們假設 SP3 和 SP4 具有不同的蛋白質捕獲機制，影響使用每種樣品純化技術時鑒定和富集的蛋白質。

在這項工作中，我們旨在比較 SP3 和 SP4 鑒定和富集的蛋白質類型。此外，我們評估了脫氧膽酸鈉 （SDC） 輔助消化的能力，以對抗 SP4 產生的蛋白質沉淀的不溶性，并增加 SP3 和 SP4 中疏水蛋白質的檢測。在本文中，我們比較了用 SP3、SP4、SP3（去污劑輔助 （DA））和 SP4（去污劑輔助 （DA））制備的樣品的鑒定蛋白質。具體來說，我們使用密歇根癌癥基金會 7 （MCF7） 乳腺癌亞細胞組分（包括細胞質、膜、可溶核、染色質結合核和細胞骨架組分）進行深度蛋白質組分析。亞細胞組分包含具有不同特性的蛋白質，并用作分級分離的一種形式，降低了全細胞裂解物的復雜性，并能夠檢測低豐度蛋白質。最終，我們的結果顯示每種清理技術鑒定和富集的蛋白質存在差異，我們與蛋白質捕獲機制的差異相關聯。

實驗程序

材料

碳酸氫銨來自 Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）。Emplura 無水乙醇和高純度脫氧膽酸鈉 （99%） 來自 VWR International （Radnor， PA）。胰蛋白酶/Lys-C 混合物（質譜級）來自 Promega（威斯康星州麥迪遜）。Glu-1-纖維蛋白肽 B 來自 Waters（馬薩諸塞州米爾福德）。所有其他物品均購自 ThermoFisher Scientific（馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。納米純水來自 Purelab Flex 3 純水系統(tǒng)（Elga，Veolia Environment S.A.，法國巴黎）。

細胞培養(yǎng)和裂解

MCF7 乳腺癌細胞（ATCC HTB-22，弗吉尼亞州馬納薩斯）在補充有 10% 胎牛血清（Gibco，Billings，MT）和 1% 青霉素/鏈霉素 （Gibco） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基（Corning，Corning，NY）中培養(yǎng)。使用 PlasmoTest TM 支原體檢測試劑盒（InvivoGen，San Diego，CA）定期檢測細胞是否受到支原體污染，并在 80% 匯合時傳代。

使用含有 0.025 M Tris、0.15 M NaCl、0.001 M EDTA、1% NP-40 和 5% 甘油的裂解緩沖液（Pierce 免疫共沉淀試劑盒，ThermoFisher Scientific）收獲全細胞蛋白。使用培養(yǎng)細胞亞細胞蛋白分級分離試劑盒 （ThermoFisher Scientific） 對 1.0 × 10⁷ 個細胞進行亞細胞蛋白分級分離。使用二辛可寧酸 （BCA） 測定法測定蛋白質濃度。通過使用每個亞細胞組分的已建立蛋白質標志物進行免疫印跡來確認亞細胞組分分離。

還原和烷基化

將蛋白質樣品加入低結合力的 1.5 mL 微量離心管中，并在 Reacti-Therm 單模塊加熱模塊 （ThermoFisher Scientific） 上在 100 °C 下使蛋白質變性 5 分鐘。在室溫下，將二硫蘇糖醇 （DTT） 添加到蛋白質樣品中（蛋白質與 DTT 摩爾比為 1：10），并將樣品在 60 °C 和 1,000 rpm 下在 Eppendorf ThermoMixer 溫度控制裝置（Eppendorf，Hamburg，Germany）上孵育 30 分鐘。然后加入碘乙酰胺 （IAA）（蛋白質與 IAA 摩爾比為 1：100），并將樣品在室溫下避光孵育 30 分鐘，以使游離半掛烴烷基化。用額外的 DTT（5：1 DTT 與 IAA 摩爾比）淬滅烷基化反應。

SP3增強樣品制備

SP3磁珠請參考http://m.5000js.com/Product/1736805216.html。Speedbead磁性羧酸鹽改性顆粒（GE45152105050250 和 GE65152105050250，GE Healthcare，芝加哥，伊利諾伊州）以 1：1 （v/v） 的比例合并，用水洗滌 3 次，并以終濃度 50 mg/mL 重懸于水中。將制備的顆粒以 10：1 （w/w） 的顆粒與蛋白質比例添加到蛋白質樣品中，并以 4：1 （v/v） 的乙腈與蛋白質比例加入冷卻的乙腈 （4 °C） 以誘導與顆粒結合。將蛋白質樣品在 ThermoMixer 上于 24 °C 和 1000 rpm 孵育 5 分鐘以增強顆粒-蛋白質結合，然后在室溫下置于 1 T 定制磁架上 5 分鐘。將帶有結合蛋白的磁性顆粒拉到微量離心管的一側，并將上清液中的污染物作為廢液去除。用 80% 乙醇水溶液 （v/v） 洗滌蛋白質-顆?；旌衔铮糜诖帕苌?span> 5 min，含污染物的上清液作為廢液除去。

SP4增強樣品制備

以 4：1 （v/v） 的乙腈與蛋白質比例加入冷凍乙腈 （4 °C），以溶解和聚集蛋白質。將樣品渦旋混合 （<500 rpm） 5 秒，然后以 16,000g 離心 10 分鐘，以使用 Fisherbrand accuSpin Micro 17 微量離心機 （ThermoFisher Scientific） 沉淀蛋白質。除去含污染物的上清液作為廢液，用 80% 乙醇水溶液 （v/v） 洗滌蛋白沉淀，以 16,000g 離心 10 min，含異物的上清液作為廢液除去。

標準消解

胰蛋白酶/賴氨酸-C 以 1：50 （w/w） 的酶蛋白比例加入 100 mM 碳酸氫銨，pH 值為 8。將蛋白質在 ThermoMixer 上于 37 °C 和 1000 rpm 消化 18 小時。然后將肽樣品置于磁力架 （SP3） 上或以 16,000g （SP4） 離心 10 分鐘，并將含肽的上清液移至干凈的樣品瓶中。

SP3 （DA） 和 SP4 （DA）去污劑輔助消化

胰蛋白酶/賴氨酸-C 以 1：50 （w/w） 的酶蛋白比例加入 100 mM 碳酸氫銨 （pH 8） 和 1% SDC（使用 10% SDC （w/v） 儲備液）。蛋白質在 ThermoMixer 上以 37 °C 和 1,000 rpm 消化 18 小時。將乙腈加入 20% （v/v） 的最終溶劑混合物中以提高疏水肽回收率，并將三氟乙酸 （TFA） 加入至 0.5% 以沉淀 SDC 并淬滅消化。將肽樣品以 16,000g 離心 10 分鐘，以沉淀去污劑和任何不溶性碎片。對于 SP3 （DA），然后將樣品放在磁力架上 5 分鐘，以確保顆粒不會被帶入儀器。然后將 SP3 （DA） 和 SP4 （DA） 樣品的肽上清液移至干凈的樣品瓶中。總結了所有四種樣品清理技術。SP3磁珠請參考http://m.5000js.com/Product/1736805216.html。

Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS)

根據 Thermo Scientific Nanodrop One 的測量結果，將肽用 99% 水、0.9% 乙腈和 0.1% 甲酸稀釋至濃度約為 ～0.5 μg/μL。將肽（2 μL）進樣到配備Waters ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18捕集柱（5 μm， 180 μm × 20 mm）的Waters nanoACQUITY UPLC色譜柱上，與Waters ACQUITY UPLC PST BEH C18 nanoACQUITY分析柱（1.7 μm、75 μm×100 mm）聯用。在 MS 分析之前，使用由溶劑 A（99.9% 水和 0.1% 甲酸）和溶劑 B（99.9% 乙腈和 0.1% 甲酸）組成的梯度來分離肽。完整的 LC 梯度如表 S2 所示。

使用Fossilion Sharp Singularity LOTUS nESI發(fā)射器（Fossiliontech，西班牙馬德里），通過Waters Z-Spray NanoLockspray電離源，將從液相色譜柱洗脫的肽噴入Waters Synapt G2-S高分辨率質譜儀中。使用 Glu-1-纖維蛋白肽 B 作為參考鎖定質量，精確 m/z 為 785.8421，用于質量校準和采集后質量校正。在正離子分辨率模式下，以下串聯 MS 參數用于數據非依賴性分析：質量分辨率：20,000，掃描范圍：50–2000 m/z，超清晰 MS^E （UDMS^E） 的傳遞碰撞能量斜坡：歌渦分箱 0–20，保持 17 eV;移動性箱 20-110，將碰撞能量從 17 eV 增加到 45 eV;移動性 bin 110–200，將碰撞能量從 45 eV 增加到 60 eV。優(yōu)化的 MS 參數如圖 S6 和表 S3 所示。

數據庫搜索

用于蛋白質組學的 Progenesis QI（4.2 版，非線性動力學，沃特世公司）用于搜索含有 80,027 種蛋白質（經典蛋白和亞型，2022 年 6 月下載）的 Uniprot Homo Sapien 參考蛋白質組 （UP000005640） 的實驗數據。為了確定僅用一種方法鑒定的肽和蛋白質的數量，我們檢索了來自單一純化技術的數據。而成對比較 （SP3 與 SP4、SP3 與 SP3 （DA） 和 SP4 與 SP4 （DA）） 通過每種方法進行火山圖、水腫總平均數 （GRAVY） 和基因本體論 （GO）-Slim 分析，以確定富集的蛋白質。導入數據，校正 Glu-1-纖維蛋白肽 B 鎖質量數，并啟用離子計數工作流程，以使用 UDMS^E 鑒定肽。使用以下搜索參數：肽和片段容差：自動，酶特異性：賴氨酸和精氨酸 C 端裂解 （/K-\P/R-\P），最大離子電荷：20，漏缺切割：最多 2，運行對齊：自動，峰挑選靈敏度：自動，最大蛋白質質量：250 kDa，離子匹配要求：5 個片段/蛋白質、2 個片段/肽和 1 個肽/蛋白質。錯誤發(fā)現率設定為 <1%，iadbs.exe Progenesis Qi 用于蛋白質組學，“動態(tài)”創(chuàng)建隨機序列。修飾包括半胱氨酸的固定脲甲基化、蛋氨酸的可變氧化以及絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的可變磷酸化。磷酸化被包括在內，因為這種常見的修飾對細胞功能至關重要，并且在乳腺癌發(fā)病機制中特別發(fā)現。使用 Hi-3 和蛋白質分組完成相對定量的自動處理，以生成原始和歸一化的蛋白質豐度、最大倍數變化和方差分析值。所有 LC-MS/MS 原始數據均已存入 MassIVE 和 ProteomeXchange 存儲庫，并帶有以下入藏號：（MSV000094130） 和 （PXD049965）。

統(tǒng)計學

對于每個生物樣品（全細胞裂解物、細胞質、膜、可溶核、染色質結合核和細胞骨架組分），為每種凈化技術（SP3、SP4、SP3（DA） 和 SP4（DA））制備三個樣品制備重復，共 72 個樣品。每個樣品完成 3 次技術儀器重復，共計 216 次儀器運行。除非另有說明，否則所有表格、圖表和條形圖都使用 Microsoft Excel（版本 2301）。成對比較的統(tǒng)計顯著性由雙尾 F 檢驗和 t 檢驗確定。在 Excel 中按描述手動搜索鑒定出的蛋白質組，以確定它們是否在一種或多種樣品純化技術中被鑒定出來。UpSet 圖用于可視化蛋白質組交叉，并使用 UpSetR 包在 R 中構建。DAVID 功能注釋工具 （2021 版，2023 年 2 月訪問）用于將蛋白質組 中的先導蛋白鑒定映射到細胞成分。將 DAVID 輸出的細胞成分手動分為以下幾類：細胞質、膜、細胞核、細胞骨架或非特異性成分。非特異性細胞組分包括無法有效歸類為其他類別的一般注釋，包括“細胞”、“細胞部分”、“細胞內細胞器”等。圖 S7 和 S8 描述了 DAVID 輸入參數以及 DAVID 的所有細胞組分輸出，以及它們如何被分組到類別中。然后構建餅圖，顯示映射到每個細胞類別的已鑒定蛋白質的百分比。在 Excel 中使用 Progenesis 的最大倍數變化和 P 值 （ANOVA） 輸出構建火山圖，以觀察每種樣品凈化技術富集的蛋白質組。使用 GRAVY 計算器 （https://www.gravy-calculator.de/index.php） 完成 GRAVY 分析，對火山圖中富集的蛋白質組進行鉛蛋白鑒定 。PANTHER （版本 17.0,2023 年 2 月訪問）用于對 Progenesis 中富集的蛋白質組進行 GO-Slim 細胞成分分析。所有 PANTHER 輸入參數如圖 S9 所示。

結果與討論

根據亞細胞組分的不同，在不同的樣品純化技術中觀察到肽和蛋白質組鑒定的增加

我們首先比較了 MCF7 細胞裂解物的每種純化方法中鑒定出的肽和蛋白質組的數量。與以前的研究一致，在比較所有四種純化技術時，SP4 能夠鑒定出全細胞裂解物中數量最多的肽和蛋白質組（圖 1）。與過去的參考文獻相比， 全細胞裂解物樣品的蛋白質鑒定似乎較少。這可能是由于用于測定樣品濃度的 Nanodrop 測量存在不確定性，因此向 LC-MS/MS 中進樣的樣品量較少。然而，我們預計影響蛋白質鑒定的最重要因素是在工作中使用飛行時間 （TOF） 質量分析儀。眾所周知，全細胞裂解物樣品的復雜性會導致 TOF 質量分析器的鑒定計數降低，即使優(yōu)化了離子淌度（圖 S6）和 Tune 頁面參數（表 S3），這是由于低豐度蛋白質的掩蓋、光譜復雜性增加和肽電離效率的差異。本研究中使用了 TOF 質量分析器，因為它能夠通過數據非依賴性采集來采集數據，并通過數據依賴性采集分析樣品中的所有離子與選定的離子。為了增加蛋白質組覆蓋率以對 MCF7 乳腺癌細胞中的低豐度蛋白質進行深度分析，使用了亞細胞組分離?？傮w而言，SP3、SP4、SP3（DA） 和 SP4（DA） 在所有亞細胞組分中分別鑒定出 3451、3517、3070 和 3094 個獨特蛋白組。與之前的研究一致，當從組合的亞細胞組分中匯集鑒定出的蛋白質組時，我們看到鑒定結果增加。

圖 1.使用 SP3、SP4、SP3（去污劑輔助 （DA））和 SP4（去污劑輔助 （DA））對 MCF7 乳腺癌全細胞裂解物和亞細胞組分的鑒定肽 （A） 和蛋白組 （B） 的平均數量進行比較。樣本由虛線分隔，圖頂部帶有標簽。誤差線表示均值的標準誤差。條形圖上方的括號線顯示成對比較的顯著性，用 *p < 0.05、**p < 0.01 和 ***p < 0.001 表示。沒有 * 表示法的比較沒有顯著差異，并且處于測量不確定度范圍內。

預計亞細胞組分具有較高的親水性或疏水性蛋白質的普遍性;因此，亞細胞組分用于評估蛋白質捕獲機制的差異。首先評估膜組分的鑒定肽和蛋白質組的數量。與所有方法相比，SP4 鑒定出膜組分中數量最多的肽和蛋白質組，其中包括包含疏水結構域的膜蛋白（圖 1）。

然后比較已鑒定的肽和蛋白質組的數量，以查找預期含有親水性蛋白質的組分，包括細胞質、可溶性核、染色質結合核和細胞骨架組分。對于細胞質組分，SP3 和 SP4 產生最多的已鑒定蛋白組，而 SP4 產生最多的肽（圖 1）。對于可溶性核和染色質結合的核組分，SP3 提供了最多的肽和蛋白質組鑒定。最后，對于細胞骨架部分，SP3 產生最多的鑒定肽，而 SP3 和 SP4 都鑒定出大量蛋白質組。當考慮到親水性蛋白（如肌動蛋白絲和微管）和疏水蛋白（包括中間絲，如角蛋白、波形蛋白和神經絲）都存在于該組分中時，預計 SP3 和 SP4 鑒定的蛋白質組的數量相似。以前，與 SP4 相比，SP3 在細胞裂解物中產生的鑒定肽和蛋白質數量較少。然而，此處介紹的結果表明，SP3 是一種有效的凈化技術，用于識別某些亞細胞組分中相似或更高數量的蛋白質組，特別是那些預計含有高豐度親水性蛋白質的組分。

在評估標準品與去污劑輔助消化時，除了使用 SP3 與 SP3 （DA） 的全細胞裂解物進行比較外，SDC 輔助消化沒有產生最高數量的鑒定肽和蛋白質組鑒定（圖 1）。預計 SDC 不會對肽和蛋白質組鑒定產生負面影響，因為它是在 LC-MS/MS 之前沉淀的（圖 S3）。然而，先前的報道表明，一些肽在消化后的酸化過程中會與 SDC 沉淀，從而減少檢測到的肽的總數。

不同的樣品凈化技術可識別不同類型的蛋白質

接下來，我們比較了使用注釋細胞成分的每種清理技術鑒定的蛋白質類型。根據它們是使用一種、兩種、三種還是所有四種純化技術鑒定，對所有鑒定的蛋白質組進行排序（圖 2）。評估通過所有純化技術鑒定的蛋白質，通過所有四種方法分別鑒定出全細胞裂解物、細胞質、膜、可溶核、染色質結合核和細胞骨架組分的 484、515、572、330、199 和 50 種蛋白質（圖 2）。然后通過 DAVID 功能注釋工具將所有純化技術鑒定的蛋白質組的先導蛋白鑒定映射到細胞成分類別。當評估通過所有四種方法在每個組分中鑒定的蛋白質時，觀察到與每個細胞成分相關的鑒定蛋白質增加，表明亞細胞分級分離是成功的（圖 S10）。然而，對于所有樣品和亞細胞組分，使用所有四種純化技術鑒定出不到 20% 的檢測到的蛋白質組，這表明基于純化技術鑒定的蛋白質組存在明顯差異。

圖 2.使用 SP3、SP4、SP3（DA） 和 SP4（DA） 對全細胞裂解物 （A）、細胞質 （B）、膜 （C）、可溶性核 （D）、染色質結合核 （E） 和細胞骨架 （F） 組分的已鑒定蛋白組數的異常圖。組大小表示每種方法的已鑒定蛋白質組的總數。條形圖顯示了用 1 種、2 種、3 種或全部4種方法鑒定蛋白質組的頻率，如條形圖下方的黑色實線圓圈所示。

然后，我們專注于比較僅使用一種純化技術鑒定的蛋白質。首先評估全細胞裂解物和膜組分，預計它們含有疏水蛋白。我們的結果表明，與這兩個樣品的其他純化技術相比，僅通過 SP4 鑒定的蛋白質數量更多（圖 2）。與所有純化技術相比，SP4 （DA） 產生的蛋白質在全細胞裂解物中映射到最高百分比的膜細胞成分 （40%） （圖 3Aiv），而 SP4 產生的蛋白質在膜部分中映射到最高百分比的膜細胞成分 （41.5%） （圖 3Cii）。這些結果表明，對于預期含有疏水性蛋白質的樣品，與 SP3 和 SP3（DA） 相比，僅通過 SP4 和 SP4（DA） 鑒定的膜蛋白更多。

圖 3.每個樣品僅通過一種純化技術鑒定的蛋白質組的細胞組分類別（列：SP3 （i）、SP4 （ii）、SP3（DA） （iii）、SP4（DA） （iv））（行：全細胞裂解物 （A）、細胞質 （B）、膜 （C）、可溶性核 （D）、染色質結合核 （E） 和細胞骨架 （F） 級分）。通過 DAVID 功能注釋工具將僅由一種純化技術鑒定的蛋白質組 （n） 映射到細胞組分，并手動分組為細胞組分類別：細胞質（純綠色）、膜（純藍色）、細胞核（方格黃色）、細胞骨架（純紅色）或非特異性（條紋灰色）。缺失餅圖表示使用指定方法在該亞細胞組分中唯一鑒定的蛋白質沒有顯著的功能注釋。類別百分比的計算方法是將類別中映射的細胞成分的數量除以映射細胞成分的總數。

對于含有親水性蛋白質（細胞質、可溶性核、染色質結合核和細胞骨架組分）的組分，還評估了僅用一種純化技術鑒定的蛋白質。在細胞質、染色質結合的核和細胞骨架組分中，與其他純化技術相比，僅由 SP3 鑒定的蛋白質數量更多（圖 2）。對于細胞質組分，SP3 （DA） 產生最高百分比的映射到細胞質細胞成分的蛋白質 （10.5%）（圖 3Biii）。對于可溶性核和染色質結合的核級分，SP3 產生的映射到核細胞成分的蛋白質百分比最高（分別為 17.3% 和 26.7%）（圖 3Di，Ei）。這些結果表明，對于含有親水性蛋白的樣品，與 SP4 和 SP4（DA） 相比，僅用 SP3 和 SP3（DA） 鑒定的細胞質和細胞核蛋白更多。

成對比較可確認富集蛋白的差異

到目前為止，我們已經比較了使用每種純化技術檢測到的蛋白質組的數量和身份的差異。然而，比較通過兩種方法捕獲但觀察到具有顯著豐度差異的蛋白質組也很重要，我們將其稱為富集差異。為了評估富集的蛋白質組，使用成對比較 （SP3 與 SP4、SP3 與 SP3 （DA） 和 SP4 與 SP4 （DA）） 生成火山圖。

首先比較 SP3 與 SP4 樣品純化技術，以確定每種方法富集的蛋白質組數。在評估含有疏水性蛋白的全細胞裂解物和膜組分時，與 SP3 相比，SP4 從全細胞裂解物（圖 4Ai）和膜組分（圖 4Ci）中富集了更多的蛋白質組。雖然富集的蛋白質數量僅占總鑒定結果的一小部分（圖 1），但 SP3 或 SP4 富集的蛋白質百分比與之前對全細胞裂解物的研究一致。此外，這些結果與以前的研究一致，這些研究表明，與 SP3 相比，SP4 在全細胞裂解物中富集了更多的蛋白質。

圖 4.Volcano 圖比較了全細胞裂解物 （A）、細胞質 （B）、膜 （C）、可溶性核 （D）、染色質結合核 （E） 和細胞骨架 （F） 組中 SP3 與 SP4 （DA） 之間富集蛋白組的數量 SP4 與 SP4 （DA） （ii） 以及 SP4 與 SP4 （DA） 之間的富集蛋白組數。比較中每種方法的富集蛋白質組數（最大倍數變化> 2，P 值< 0.05）顯示在每個面板的頂部。突出顯示的面板表示在每次成對比較中產生最高富集蛋白組數的方法。

比較 SP3 與 SP4 對于預期含有親水性蛋白質的亞細胞級分，SP3 在染色質結合的核（圖 4Ei）和細胞骨架級分（圖 4Fi）中富集了更多的蛋白質組。與由 SP4 富集的 0 個蛋白組相比，SP3 還富集了更多的可溶性核組分蛋白組（圖 4Di）。對于細胞質部分，與 SP3 相比，SP4 富集了更多的蛋白質組（圖 4Bi）。然而，有許多蛋白質組同時被 SP3（147 個蛋白質組）和 SP4（181 個蛋白質組）富集（圖 4Bi），表明 SP3 和 SP4 富集了細胞質組分中的不同蛋白質。因此，與 SP4 相比，SP3 豐富了細胞核和細胞骨架組分中更多蛋白質基團的鑒定。

還比較了標準酶解與去污劑輔助消化的富集蛋白組數。雖然去污劑輔助消化不會產生最多的肽和蛋白質組鑒定（圖 1），但與 SP3 相比，SP3（DA） 在全細胞裂解物（圖 4Aii）和膜（圖 4Cii）組分中富集了更多的蛋白質組，而與全細胞裂解物中的 SP4 相比，SP4（DA） 富集了更多的蛋白質組（圖 4Aiii）。此外，在預期含有更多親水性蛋白質的亞細胞級分中，與去污劑輔助消化相比，標準消化富集了更多的蛋白質組（圖 4Bii、Dii、Eii、Fii、Biii、Diii、Eiii、Fiii）。這些結果表明，對于含有親水性蛋白質的餾分，與去污劑輔助酶解相比，標準酶解富集了更多的蛋白質組。

通過每種純化技術富集的蛋白質都依賴于疏水性

到目前為止，我們的數據表明，每種純化技術捕獲的蛋白質都取決于蛋白質疏水性。為了確認 SP3 富集親水性更強的蛋白質，而 SP4 富集更疏水性的蛋白質，計算了 GRAVY 評分，用于從火山圖中富集蛋白組的先導蛋白鑒定（圖 4）。將富集蛋白的 GRAVY 評分繪制為頻率分布，以比較不同凈化方法之間疏水性的差異。親水性或疏水性更強的蛋白質的 GRAVY 評分分別轉移到圖中更負或更正的區(qū)域。大多數蛋白質包含親水性和疏水性結構域，因此預計許多 GRAVY 評分在 -0.2 到 0.2 之間。在比較 GRAVY 圖時，這可能導致峰頂點的相似性; 因此，我們專注于比較 GRAVY 曲線中得分超出此范圍的肩部，以檢查每種方法富集的蛋白質疏水性的差異。

首先比較了 SP3 與 SP4 在全細胞裂解物和預期含有更多疏水蛋白的膜組分中的 GRAVY 曲線。對于全細胞裂解物，SP4 的 GRAVY 曲線的峰頂點為 -0.4，SP3 曲線的峰頂點為 -0.5（圖 5Ai）。與 SP4 相比，SP3 在圖的更負區(qū)域也有一個肩部，與 SP3 相比，在曲線的正區(qū)域由 SP4 富集的蛋白質數量更多（圖 5Ai）。這些結果與之前的研究一致，表明與 SP3 相比，SP4 富含的蛋白質更具疏水性。在膜部分，SP3 和 SP4 具有相似的峰頂點，但與 SP4 相比，SP3 曲線在 GRAVY 圖的更負區(qū)域有一個肩部（圖 5Ci）。因此，對于全細胞裂解物和膜組分，SP3 富集了與 SP4 相似或更親水性的蛋白質。

圖 5.SP3 與 SP4 （i）、SP3 與 SP3（DA） （ii） 和 SP4 與 SP4（DA） （iii） 的全細胞裂解物 （A）、細胞質 （B）、膜 （C）、可溶核 （D）、染色質結合核 （E） 和細胞骨架 （F） 級分中富集蛋白組的鉛蛋白鑒定的總體平均數 （GRAVY） 評分分布。負 GRAVY 值越多表示親水性蛋白質越多，而正值越多表示疏水性蛋白質越多。垂直線表示峰頂點，以幫助比較分布。

然后比較 SP3 與 SP4 純化技術對預期含有親水性蛋白質的組分。對于細胞質部分，SP3 峰頂點為 -0.5，SP4 峰頂點為 -0.4。與 SP4 相比，SP3 的 GRAVY 曲線移動到圖中更負的區(qū)域，并且 SP4 曲線在圖的正區(qū)域有一個肩部，GRAVY 評分為 0.5（圖 5Bi）。對于可溶性核級分，火山圖顯示與 SP3 相比，SP4 沒有富集任何蛋白質（圖 4Di），因此沒有在 SP3 和 SP4 之間進行 GRAVY 比較（圖 5Di）。對于染色質結合的核級分，SP3 峰頂點移至更負的區(qū)域，并且圖的負區(qū)和陽性區(qū)都有肩部（圖 5Ei）。然而，陽性區(qū)域的肩部的 GRAVY 評分在 -0.2 到 0.2 之間，表明 SP3 富集了包含親水性和疏水性結構域的蛋白質。對于細胞骨架部分，SP3 GRAVY 曲線比 SP4 曲線更多地延伸到陽性區(qū)域，但 SP4 在非常負區(qū)捕獲一個蛋白質，在非常陽性區(qū)域捕獲一個蛋白質（圖 5Fi）。對于該部分，與其他細胞組分相比，富集的蛋白質數量較少，并且數據顯示 SP3 和 SP4 富集的蛋白質具有親水性和疏水性蛋白質的屬性。我們對預期含有親水性蛋白質的細胞組分的結果表明，與 SP4 富集的蛋白質相比，SP3 富集的蛋白質相似或更親水性。

富集的蛋白質是總蛋白質組鑒定的一小部分（圖 1）。我們的結果表明，SP3 富集的蛋白質類似于或比 SP4 富集的蛋白質更親水性（圖 5）。這與通過單個樣品凈化技術捕獲的蛋白質差異一致（圖 3），其中我們觀察到與 SP4 相比，SP3 對親水細胞成分的蛋白質注釋增加。相比之下，SP3 僅在可溶性核和染色質結合的核組分中鑒定出更親水性的核蛋白（圖 3Di，Ei），而全細胞裂解物和膜性組分中更疏水性的膜蛋白僅通過 SP4 鑒定（圖 3Ai，Ci）。因此，富集蛋白質的疏水性差異（圖 5）與 SP3 與 SP4 實現的蛋白質組鑒定的預期疏水性差異一致（圖 3）。

還檢查了比較標準和洗滌劑輔助消化的 GRAVY 曲線（圖 5）。對于含有親水性蛋白質的組分（例如細胞質、可溶性核、染色質結合核和細胞骨架組分），標準消化的 GRAVY 曲線在圖的親水區(qū)域中具有肩部。而對于含有疏水蛋白的全細胞裂解物和膜組分，在去污劑輔助消化中觀察到延伸到圖的疏水區(qū)域的肩部。因此，與去污劑輔助消化相比，標準消化增加了對相似或更親水性蛋白質的檢測，而與標準消化相比，去污劑輔助消化增加了對更多疏水性蛋白質的檢測。

以前，我們評估了僅通過一種清理技術鑒定的蛋白質的細胞成分注釋的差異（圖 3）。細胞成分本體論的分析將富集的蛋白質（圖 4）與執(zhí)行分子功能的基因及其在細胞中的相關定位聯系起來。這可以進一步了解在成對比較中差異富集的蛋白質組的生物學意義。GO 分析通過計算在樣品中觀察到蛋白質的概率相對于在整個人類蛋白質組中觀察到蛋白質的概率，將蛋白質組映射到細胞成分本體。

首先通過 PANTHER 將來自全細胞裂解物和膜組分的火山圖（圖 4）的富集蛋白組映射到細胞成分本體，以比較 SP3 與 SP4。亞細胞級分的其他 GO 分析可在圖 S9 中找到。在全細胞裂解物中，SP3 富集的蛋白質組定位于細胞質、膜、核和細胞骨架細胞成分本體，而 SP4 富集的蛋白質組定位于膜細胞成分本體（圖 6）。預計全細胞裂解物包含所有細胞成分本體;因此，SP4 僅富集映射到膜細胞成分本體的蛋白質組這一事實進一步證實了 SP4 識別（圖 1 和 3）和富集（圖 4 和 5）疏水性膜蛋白的能力。同樣，在膜組分中，SP3 富集的蛋白質組映射到膜和細胞骨架細胞成分本體，而 SP4 富集的蛋白質組僅映射到膜細胞成分本體（圖 6）。這些結果與 SP3 鑒定（圖 3Di，Ei）和富集（圖 5）的親水性蛋白的增加一致;以及 SP4 在全細胞裂解物和膜組分中鑒定（圖 3Ai，Ci）和富集（圖 5Ai）的疏水性膜蛋白。這些結果表明，SP3 富含具有親水性和膜蛋白的映射到細胞成分本體的蛋白質，而僅觀察到 SP4 具有疏水性蛋白富集映射到膜細胞成分本體的蛋白質。

圖 6.SP3 與 SP4 以及標準與去污劑輔助消化的 GO-Slim 細胞成分本體的比較。條形圖表示一種清理方法與另一種清理方法中與顯著富集的細胞組分本體相關的基因數量。條形顏色表示細胞成分本體的分組類別：細胞質（純綠色）、膜（純藍色）、細胞核（方格黃色）、細胞骨架（純紅色）或非特異性（條紋灰色）。

還使用 GO-Slim 評估了由標準消化和洗滌劑輔助消化富含的蛋白質組，以對 SP3 與 SP3 （DA） 和 SP4 與 SP4 （DA） 進行成對比較。通過全細胞裂解物（圖 6）和膜組分（圖 S9）中的標準消化富集的蛋白質組映射到細胞質、膜、核和細胞骨架細胞成分本體。而由去污劑輔助消化富集的蛋白質組僅映射到膜細胞成分本體（圖 6 和 S9）。這些結果進一步證實，與標準消化相比，去污劑輔助消化提高了檢測膜蛋白的能力。

SP3 與 SP4 的蛋白質捕獲和富集的機制差異

SP3 最初被提議通過類似 HILIC 的機制捕獲蛋白質，使用兩種類型的親水性、羧酸鹽修飾的顆粒，這些顆粒的表面親水性不同。（11） 然而，最近的一項研究表明，在 SP3 中，蛋白質聚集主要負責蛋白質捕獲，而不是 HILIC 樣相互作用驅動 SP3 中的蛋白質捕獲。如果 SP3 的蛋白質捕獲僅依賴于蛋白質聚集，我們預計 SP3 和 SP4 中鑒定的蛋白質會產生相似的蛋白質鑒定，尤其是在檢查樣品復雜性降低的亞細胞組分時。然而，我們的結果表明，每種方法鑒定的蛋白質組存在明顯差異（圖 2），SP3 和 SP4 鑒定的單個組分中不到 45% 的蛋白質組。我們的結果表明，在全細胞裂解物和膜組分中，SP4 能夠鑒定和富集與 SP3 鑒定的蛋白質相似或更疏水的蛋白質。疏水性蛋白質含有更多的不溶性氨基酸，這使得蛋白質在蛋白質聚集機制中添加有機溶劑后能夠很好地聚集。這些結果與之前的工作一致，后者表明與 SP3 相比，SP4 在細胞裂解物中富集了低溶解度蛋白質。

我們的結果還表明，對于預期含有親水性蛋白質的組分，SP3 能夠識別（圖 1-3）和富集（圖 4-6）與 SP4 相比相似或更親水性的蛋白質。如果蛋白質聚集驅動了 SP3 中的蛋白質捕獲，那么與我們觀察到的 SP4 相比，我們預計會看到具有相似富集水平的相似蛋白質。然而，與 SP4 相比，我們觀察到 SP3 鑒定出的親水性蛋白更多，這一事實表明，與羧酸鹽修飾顆粒的 類HILIC 相互作用也在捕獲 SP3 蛋白中發(fā)揮作用。親水性蛋白質對極性官能團（如羧酸鹽）具有更大的親和力，這種親和力基于氨基酸序列中極性和帶電官能團的數量，這些官能團可以通過氫鍵、偶極相互作用和鹽橋與羧酸鹽基團相互作用。蛋白質的氨基酸序列越親水，就越有可能與羧酸鹽修飾的顆粒相互作用。因此，這些結果表明 SP3 和 SP4 的蛋白質捕獲機制不同，每種純化技術的蛋白質捕獲都取決于蛋白質疏水性。

結論

蛋白質組學實驗能夠鑒定生物學相關樣品中的肽和蛋白質，以確定疾病中的重要蛋白質生物標志物。在此，我們比較了 SP3、SP4、SP3（DA） 和 SP4（DA），并表明 SP3 和 SP4 蛋白質捕獲機制與每種純化技術的蛋白質捕獲不同，具體取決于蛋白質疏水性。我們的結果表明，SP3 通過類 HILIC相互作用和蛋白質聚集機制的組合捕獲蛋白質，而 SP4 似乎僅通過蛋白質聚集機制捕獲蛋白質。此外，去污劑輔助消化改善了全細胞裂解物和膜組分中疏水性膜蛋白的鑒定。SP3磁珠請參考http://m.5000js.com/Product/1736805216.html。

盡管理想的蛋白質組學方法可以成功捕獲生物樣品中的所有蛋白質，但我們表明 SP3 和 SP4 捕獲不同的蛋白質。因此，樣品純化技術的選擇（SP3 與 SP4）可能會使蛋白質組學實驗中鑒定的蛋白質產生偏差。為了捕獲具有不同疏水性的多種蛋白質，可能需要多種樣品凈化技術。或者，如果研究人員有興趣鑒定具有預期疏水性的目標一類蛋白質，例如預期具有疏水性的跨膜蛋白，則可以選擇特定的樣品凈化方法，例如 SP4。最終，選擇最佳樣品純化方法可以增加復雜樣品的蛋白質組覆蓋率，這將有助于深入分析蛋白質在調節(jié)細胞活性和導致疾病方面的重要作用。