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       在生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，Protein A作為一種重要的工具蛋白，在抗體純化、免疫沉淀等實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮著不可或缺的作用。本文將深入探討Protein A的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)用及其與其他相關(guān)蛋白（如Protein G和Protein A/G）的區(qū)別，旨在為讀者提供一個(gè)全面而深入的理解。

關(guān)鍵點(diǎn)

• 蛋白A是從金黃色葡萄球菌中提取的一個(gè)重要抗體結(jié)合蛋白，已在抗體純化中應(yīng)用超過(guò)80年。
• 蛋白A具有較高的IgG結(jié)合親和力，主要通過(guò)與IgG的Fc區(qū)進(jìn)行非共價(jià)相互作用。
• 研究表明，工程化的蛋白A可以在更溫和的條件下進(jìn)行抗體純化，減少抗體的聚合。
• 由于穩(wěn)定性提升，工程化的蛋白A如Z域、C域等在不同pH環(huán)境下表現(xiàn)優(yōu)異，適合于高樣品負(fù)載的應(yīng)用。
• 各種非特異性結(jié)合和雜質(zhì)去除的方法已被提出，以提高抗體純化的選擇性和效率。
• 納米顆粒（如磁性納米顆粒）作為新的支持材料已被成功應(yīng)用于蛋白A的結(jié)合和抗體的純化。
• 蛋白A還有潛在的應(yīng)用于生物傳感器，用于低濃度抗體的快速檢測(cè)。

       由于抗體對(duì)病毒性疾病、癌癥、風(fēng)濕病和其他神經(jīng)系統(tǒng)的治療作用，它們的產(chǎn)生和純化呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。2019 年，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局 （FDA） 批準(zhǔn)了 PD-1 抗體和抗 EGFR mAb 等 90 種 mAb（單克隆抗體），而超過(guò) 50 種 mAb 仍處于臨床試驗(yàn)階段。此外，在治療中，它可以直接附著以激活固體支持物，并用作檢測(cè)抗原的敲擊劑 。
       抗體中的哪些功能會(huì)導(dǎo)致這些特性？免疫球蛋白，即 Igs，分子量約為 150 kDa，兩條重鏈有 450-650 個(gè)氨基酸和兩條輕鏈有 214 個(gè)氨基酸，斯托克斯半徑為 4 nm，等電點(diǎn)在 4.0-8.6 范圍內(nèi)。它們由四條多肽鏈組成。兩條相同的 50 kDa γ重鏈和兩條相同的 25 kDa k 或 λ 輕鏈，可產(chǎn)生約 150 KDa 的蛋白質(zhì)（IgG1、IgG2、IgG4 為 146 KDa，IgG3 為 170 KDa）。兩條重鏈通過(guò)二硫鍵在鉸鏈中連接：IgG1 和 IgG4 的兩個(gè)鍵，IgG2 的 4 個(gè)鍵和 IgG3 的 11 個(gè)鍵。此外，輕鏈的最后一個(gè)半胱氨酸殘基和重鏈的第五個(gè)半胱氨酸殘基產(chǎn)生二硫鍵帶。基于由 82-96% 蛋白質(zhì)和 4-18% 碳水化合物組成的糖蛋白，人體中的五類(lèi) Ig 是 IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE。根據(jù) IgG 的結(jié)構(gòu)差異，將其分為四個(gè)亞類(lèi);IgG1、IgG2、IgG3 和 IgG4 在氨基酸水平上相同 90% 以上，而這些小于 10% 的差異（圖 1）對(duì)它們的功能和對(duì)各種類(lèi)型抗原的反應(yīng)起著重要作用。值得注意的是，幾乎所有已使用或未開(kāi)發(fā)的抗體都使用 IgG1 亞類(lèi)骨架。

圖 1.A） 四個(gè)亞類(lèi)，B） IgG 及其片段的四肽鏈（重鏈;紅色和綠色，輕鏈;黃色）。

       基于 Ig結(jié)構(gòu)，Ig 分為兩條重鏈和兩條輕鏈。重鏈包括 N 末端可變結(jié)構(gòu)域 （VH） 和三個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域 （CH1、CH2 和 CH3），而輕鏈由 N 末端結(jié)構(gòu)域 （VL） 和一個(gè)恒定結(jié)構(gòu)域 （CL） 組成。根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)，Ig 分為兩部分;兩個(gè)片段抗原結(jié)合位點(diǎn) （Fab） 區(qū)域和一個(gè)片段可結(jié)晶 （Fc） 區(qū)域（圖 1）。Fab 和 Fc 區(qū)通過(guò)二硫鍵連接在一起，稱(chēng)為柔性鉸鏈區(qū)。Fab 作為高選擇性位點(diǎn)與抗原結(jié)合，而 Fc 區(qū)與許多不同的蛋白質(zhì)結(jié)合，例如含有新生兒 Fc 受體的細(xì)胞表面受體和細(xì)菌蛋白，如蛋白 A 和蛋白 G 。
       IgG3 具有 11 個(gè)二硫鍵，而其他 IgG 亞類(lèi)（IgG1、IgG2 和 IgG4）中只有 2-4 個(gè)二硫鍵。它導(dǎo)致 IgG3 有 13 種不同的多態(tài)性，稱(chēng)為同種異型，而 IgG1、IgG2 和 IgG4 分別為 4、1 和 0 種同種異型。這種差異僅導(dǎo)致 IgG3 與蛋白 G 或蛋白 A/G 相互作用，而不與蛋白 A 相互作用。
       到目前為止，一些已發(fā)表的綜述研究了用于 Ig 親和純化的不同種類(lèi)的 Protein A，例如蛋白 A 模擬肽和工程蛋白，并比較了不同類(lèi)型的市售 Protein A 基質(zhì)及其性質(zhì) .納米抗體較小的替代抗體形式，例如抗原結(jié)合片段 （Fab） 或帶有末端六組氨酸標(biāo)簽的單鏈可變片段 （scFv），很容易通過(guò)固定化金屬親和色譜純化，但以前的研究表明 His 標(biāo)簽對(duì)納米抗體生物分布有負(fù)面影響。

一、Protein A的來(lái)源與結(jié)構(gòu)

Protein A是一種來(lái)源于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的表面蛋白，其分子量約為42KDa。作為微生物來(lái)源的天然蛋白質(zhì)，Protein A具有與哺乳動(dòng)物的免疫球蛋白（尤其是IgG）特異性結(jié)合的能力。這一特性使得Protein A在抗體純化、免疫沉淀等生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。普睿邁格提供高質(zhì)量重組蛋白A（http://m.5000js.com/Product/6945134937.html）。

圖2. A) 蛋白A基因組成包含信號(hào)序列（S）、五個(gè)IgG結(jié)合域（D、E、A、B和C）、細(xì)胞壁附著區(qū)域（XM），B) IgG Fc區(qū)的三個(gè)β轉(zhuǎn)角（灰色片段，上部蛋白）與蛋白A的B域的兩個(gè)α螺旋（紅色片段，下部蛋白）之間的相互作用。IgG 結(jié)合結(jié)構(gòu)域：E、D、A、B 和 C（每個(gè)結(jié)構(gòu)域 58 個(gè)氨基酸殘基）沉降在反平行的三個(gè)α螺旋中，所有結(jié)構(gòu)域都顯示出與 IgG 的 Fc 區(qū)亞類(lèi)（IgG1、IgG2 和 IgG4）的單獨(dú)相互作用，具有親和常數(shù)，KA 為 108 （?1），對(duì) IgG3 的親和力非常弱。

• 5個(gè)同源的IgG結(jié)合域（E、D、A、B、C），每個(gè)結(jié)構(gòu)域均可結(jié)合IgG的Fc區(qū)域（Fahnestock et al., 1986）。
• 一個(gè)C端的細(xì)胞壁錨定結(jié)構(gòu)域。
• 研究表明，其對(duì)不同物種和IgG亞類(lèi)的結(jié)合效率存在差異，例如對(duì)人和兔IgG的結(jié)合能力較強(qiáng)，而對(duì)鼠、山羊等IgG的結(jié)合較弱（Hober et al., 2007）。
• 重組Protein A的優(yōu)化
• 為克服天然Protein A與部分IgG亞類(lèi)結(jié)合的局限性并提高穩(wěn)定性，科研人員開(kāi)發(fā)了重組Protein A（如rProtein A），通過(guò)引入點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)其耐堿性或改變親和力（Jansson et al., 1998）。這些改進(jìn)降低了配體脫落風(fēng)險(xiǎn)，并延長(zhǎng)了層析介質(zhì)壽命。

       結(jié)構(gòu)上，Protein A由多個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合IgG的Fc區(qū)段，而與Fab區(qū)或輕鏈的結(jié)合則相對(duì)較弱。此外，天然的Protein A還含有一些未知功能的非Fc結(jié)合域，這些區(qū)域在Protein A與雜蛋白的結(jié)合中可能發(fā)揮一定作用，從而影響純化后IgG的純度。

       CIP 是親和層析過(guò)程中的必要步驟，用于從純化設(shè)備中去除聚集的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等污染物。CIP 通常以一種簡(jiǎn)單易行的方式使用濃度為 0.1 M 的氫氧化鈉 （NaOH） 作為最有效的清潔劑>去除緊密結(jié)合的變性和聚集物種，并滅活大多數(shù)微生物，如細(xì)菌、病毒和內(nèi)毒素 。雖然這種方法很容易使用并以低成本實(shí)現(xiàn)，但所有設(shè)備、蛋白質(zhì)和基質(zhì)都必須在高 pH 值下保持穩(wěn)定。為了提高蛋白 A 在堿 pH 值的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)工程取得了成功的結(jié)果，其中最著名的是對(duì)源自 B 結(jié)構(gòu)域的 Z 結(jié)構(gòu)域的研究 。
       Nilsson 于 1987 年根據(jù)蛋白 A 的 B 結(jié)構(gòu)域的第二個(gè)結(jié)構(gòu)提出了 Z 結(jié)構(gòu)域的第一個(gè)概念。根據(jù)這些文章，直接參與 Fc 區(qū)和蛋白 A 相互作用的氨基酸位于每個(gè)結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)螺旋上。盡管如此，研究證明，存在于結(jié)構(gòu)域 E、D 和 A 中的蛋氨酸殘基會(huì)增加蛋白 A 的敏感性。此外，在 28-29 位存在天冬酰胺-甘氨酸 （Asn-Gly） 對(duì)高 pH 值敏感，并且在 CIP 惡劣條件下脫氨基。該反應(yīng)是自發(fā)的、依賴(lài)于水的，并因氫氧根離子而加速。因此，缺乏 Asn-Gly 和降低水分含量是可取的。

• 選擇合適的偶聯(lián)條件：不同的偶聯(lián)條件會(huì)影響Protein A與抗體的結(jié)合效率和穩(wěn)定性。因此，在選擇偶聯(lián)條件時(shí)需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化。
• 控制洗脫條件：洗脫條件是影響純化效果的關(guān)鍵因素之一。通過(guò)調(diào)整洗脫液的pH值、離子強(qiáng)度等參數(shù)，可以?xún)?yōu)化洗脫效果，提高抗體的純度和回收率。
• 避免非特異性結(jié)合：非特異性結(jié)合是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一。為了減少非特異性結(jié)合的發(fā)生，可以在實(shí)驗(yàn)中加入適量的抑制劑或進(jìn)行預(yù)清除處理。
• 注意實(shí)驗(yàn)安全：由于Protein A來(lái)源于金黃色葡萄球菌等微生物，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要注意無(wú)菌操作和安全防護(hù)，避免實(shí)驗(yàn)污染和交叉感染的發(fā)生。

總之，Protein A作為一種重要的生物技術(shù)工具，將在未來(lái)的科學(xué)研究和技術(shù)創(chuàng)新中發(fā)揮更加重要的作用。我們相信，在不久的將來(lái)，Protein A將會(huì)為生物科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展帶來(lái)更多的驚喜和突破。