包涵體純化與復(fù)性的方法簡(jiǎn)介與案列介紹
包涵體的純化和復(fù)性總結(jié)
包涵體折疊復(fù)性的方法應(yīng)具備以下幾個(gè)特點(diǎn)：較高的活性蛋白質(zhì)回收率；復(fù)性產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)分離；折疊復(fù)性后能夠得到較高濃度的蛋白；折疊復(fù)性方法易于放大等。蛋白復(fù)性的過(guò)程通常分為以下幾個(gè)步驟：
包涵體的洗滌
包涵體在溶解之前需要進(jìn)行洗滌，包涵體中主要含有重組蛋白，但也有一些雜質(zhì)，如一些外膜蛋白、質(zhì)粒DNA等，這些雜質(zhì)會(huì)與包涵體粘連在一起，可以通過(guò)洗滌去除大多數(shù)雜質(zhì)，但無(wú)法將雜蛋白去除干凈。
包涵體的洗滌通常選用濃度較低的變性劑，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗滌包涵體。此外可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。同時(shí)，因?yàn)槿ス竸┑南礈炷芰?huì)隨溶液離子強(qiáng)度升高而加強(qiáng)，所以在洗滌包涵體時(shí)可加入低濃度的尿素或高濃度的NaCl，使包涵體的純度達(dá)到50%以上。
包涵體的溶解
變性劑如尿素、鹽酸胍，主要是通過(guò)離子間的相互作用，打斷包涵體蛋白分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽延伸。鹽酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，它能溶解尿素不溶的包涵體。SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物、Sarkosyl等也可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，溶解一些包涵體蛋白質(zhì)。
另外，從某些含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)中分離出的包涵體，通常含有一些鏈間形成的二硫鍵和鏈內(nèi)的非活性二硫鍵，這就還需加入還原劑，如巰基乙醇、二硫基蘇糖醇（DTT）、二硫赤蘚糖醇、半胱氨酸等。這種還原性試劑能夠同半胱氨酸形成各種二硫化物中間體，也會(huì)被復(fù)性用的二硫化物置換試劑所取代。二硫鍵的形成和斷裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫鍵形成，這個(gè)平衡才會(huì)被破壞。
| 常用變性劑對(duì)比 | ||
|---|---|---|
| 尿素（8-10M） | 較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90% |
用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質(zhì)復(fù)性后除去不會(huì)造成大量蛋白質(zhì)沉淀 溶解的包涵體可選用多種色譜法純化 |
| 鹽酸胍（6-8M） | 溶解能力達(dá)95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質(zhì)的共價(jià)修飾 |
成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復(fù)性后除去可能造成大量蛋白質(zhì)沉淀 對(duì)蛋白質(zhì)離子交換色譜有干擾 |
包涵體的復(fù)性
復(fù)性是指通過(guò)去除變性劑使目標(biāo)蛋白從完全伸展的變性狀態(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑確保二硫鍵正常形成。一般在尿素濃度4M左右時(shí)復(fù)性過(guò)程開始，到2M左右時(shí)結(jié)束；鹽酸胍可以從4M開始，到1.5M 時(shí)結(jié)束。復(fù)性方法主要采用稀釋復(fù)性，透析復(fù)性和柱上復(fù)性，具體對(duì)比如下：
| 復(fù)性技術(shù) | 簡(jiǎn)介 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
|---|---|---|---|
| 稀釋復(fù)性 | 用折疊緩沖液快速稀釋溶解的包涵體蛋白質(zhì)溶液，達(dá)到降低變性劑濃度的目的，使去折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行再折疊 | 簡(jiǎn)單 |
慢 蛋白會(huì)被稀釋到很低濃度 體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制 |
| 透析復(fù)性 | 通過(guò)逐漸降低外透液濃度來(lái)控制變性劑去除速度 |
簡(jiǎn)單 不增加體積 |
慢 使用大量緩沖液 不適合大規(guī)模操作，無(wú)法應(yīng)用到生產(chǎn)規(guī)模 |
| 分子篩層析 | 分子篩效應(yīng)可將蛋白質(zhì)和小分子變性劑分離，實(shí)現(xiàn)溶液交換和蛋白質(zhì)的折疊 | 在一步操作中直接進(jìn)行自動(dòng)化復(fù)性并純化 | 樣品體積受限 |
| 離子交換層析 | 減少導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集的分子間相互作用，可將蛋白質(zhì)結(jié)合在分離介質(zhì)上，達(dá)到溶液中變性劑濃度的稀釋和蛋白質(zhì)的折疊 |
快速并簡(jiǎn)單 直接進(jìn)行自動(dòng)化 |
應(yīng)避免使用與離子交換自相反電荷的添加 |
復(fù)性的檢測(cè)
根據(jù)具體的蛋白性質(zhì)和需要，可以從生化、免疫、物理性質(zhì)等方面對(duì)蛋白質(zhì)的復(fù)性效率進(jìn)行檢測(cè)。
- 凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測(cè)變性和天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)有二硫鍵的蛋白復(fù)性后二硫鍵的配對(duì)情況。
- 光譜學(xué)方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學(xué)特征進(jìn)行復(fù)性情況的檢測(cè)，但一般只用于復(fù)性研究中的過(guò)程檢測(cè)。
- 色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。
- 生物學(xué)活性及比活測(cè)定：一般用細(xì)胞方法或生化方法進(jìn)行測(cè)定，較好的反映了復(fù)性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測(cè)活方法測(cè)得的結(jié)果不同，而且常常不能完全反映體內(nèi)活性。
- 黏度和濁度測(cè)定：復(fù)性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時(shí)由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。
- 免疫學(xué)方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)決定簇的抗體檢驗(yàn)，比較真實(shí)的反映了蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。
蛋白復(fù)性過(guò)程的添加劑
- 共溶劑：如PEG6000-20000，據(jù)說(shuō)可以可逆的修飾折疊中間體的疏水集團(tuán)，此外由于阻止了蛋白質(zhì)分子間的相互接觸的機(jī)會(huì)，也可能對(duì)復(fù)性效率的提高起作用。一般的使用濃度在0.1%左右，具體條件可根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件確定。
- 二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）和脯氨酸異構(gòu)酶（PPI）：PDI可以使錯(cuò)配的二硫鍵打開并重新組合，從而有利于恢復(fù)到正常的結(jié)構(gòu)，此外在復(fù)性過(guò)程中蛋白質(zhì)的脯氨酸兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變需要較高能量，常常是復(fù)性過(guò)程中的限速步驟，而PPI的作用是促進(jìn)兩種構(gòu)象間的轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)復(fù)性的進(jìn)行。
- 分子伴侶，即熱休克蛋白（HSP），是一種沒有蛋白質(zhì)特異性的促進(jìn)折疊的蛋白因子，研究發(fā)現(xiàn)很多蛋白在缺乏分子伴侶時(shí)無(wú)法自己正確的折疊。有人構(gòu)建了與伴侶分子共同表達(dá)的菌株，據(jù)說(shuō)效果不錯(cuò)。不過(guò)在生產(chǎn)中還沒有看到2和3的應(yīng)用的例子。
- 0.4-0.6ML-Arg：成功的應(yīng)用于很多蛋白如t-PA的復(fù)性中，可以抑制二聚體的形成。
- 甘油：增加黏度，減少分子碰撞機(jī)會(huì)，一般使用濃度在5%-30%。
- 輔助因子：添加蛋白質(zhì)活性狀態(tài)必須的輔助因子如輔酶輔基等或蛋白配體等很多時(shí)候?qū)Φ鞍踪|(zhì)正確的折疊是有利的。 色譜法：通過(guò)將目標(biāo)蛋白結(jié)合到層析柱上，減少蛋白分子間的相互影響，該方法得到越來(lái)越多的應(yīng)用，常用的色譜有SEC、HIC、IEC、IMAC等。
案例介紹
包涵體沉淀的溶解、重折疊和離子交換層析
材料和設(shè)備
Tiss-Tearor 勻漿器
透析袋（Spectra/Por?6）
陽(yáng)離子交換柱
SDS-PAGE電泳裝置
試劑
緩沖液A（1000mL）
1mol/L Tris-HCl（PH 7.9）50mL，50mmol/L
0.5mol/L EDTA 1mL，0.5mmol/L
5mol/LNaCl 10ml，50mmol/L
甘油 50mL，5%
緩沖液A+50%甘油
脫氧膽酸鈉（DOC）
N-十二烷基胺酸鈉（SKL）
操作程序
用N-十二烷基胺酸鈉溶解包涵體沉淀
- 加18mL緩沖液A和2mL 20% DOC儲(chǔ)存于包涵體沉淀中。用組織破碎器充分重懸沉淀，室溫下靜置至少10min。
- 懸液于4℃、13000r/min離心10min。棄去上清（注意留樣，樣品C），為確保沉淀得到充分洗滌，再次按步驟一的操作重懸沉淀。將懸液分成倆個(gè)相等的部分，編號(hào)#1和#2，于4℃、13000r/min離心10min。
- 對(duì)#1管中的沉淀，加19.7mL的緩沖液A和0.3mL的20%SKL儲(chǔ)液。劇烈攪動(dòng)使沉淀慢慢溶解。然后靜置30min。
- #1管中溶解的蛋白懸液，置于4℃、13000r/min離心10min。收集上清液，棄去沉淀。
透析除去去污劑使可溶性蛋白重折疊
- 對(duì)溶解的物料進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，必需用含有0.3% SKL的牛血清蛋白）。用緩沖液A+0.3% SKL稀釋，將溶解的蛋白濃度調(diào)至1mg/mL。
- 用緩沖液A將溶解蛋白制備液稀釋10倍，使蛋白終濃度約為0.1mg/mL，SKL終濃度約為0.03%。
- 4℃下，溶解蛋白制備物（約200mL），用2000mL緩沖液A透析8h（每4h，取150uL樣品，用HPLC測(cè)定去垢劑含量），同時(shí)充分?jǐn)嚢琛Ｈ缓髶Q新鮮緩沖液并重復(fù)。
離子交換層析
- 從透析袋中移出經(jīng)透析的蛋白質(zhì)溶液，4℃、8000r/min離心20min，除去所有聚集物。
- 留上清（樣品J），加載于POROS 50S陽(yáng)離子交換柱，作為后一級(jí)的分級(jí)分離。
- 用緩沖液A洗滌層析用的介質(zhì)，然后將其傾入帶適配器接頭的玻璃柱中，裝成一總體積為5mL的層析柱。用緩沖液A+1mol/L NaCl洗柱。并用緩沖液A平衡柱子。
- 如透析是在低鹽環(huán)境下進(jìn)行，則可在室溫下以4mL/min的流速直接將蛋白樣品加載于層析柱上。
- 用緩沖液A洗柱15min，然后在60min內(nèi)，以4mL/min的流速，進(jìn)行梯度洗脫（0-1mol/L NaCl/緩沖液A）。檢測(cè)260nm和280nm處的吸收，分部收集4mL組分。
- SDS-PAGE電泳分析各組分，并合并峰組分進(jìn)行進(jìn)一步分析。合并的組分可通過(guò)對(duì)緩沖液A+50%透析，制備后儲(chǔ)存。
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