經驗筆記：磁微粒化學發(fā)光法檢測原理、詳細步驟.....（值得收藏）
化學發(fā)光技術是近二、三十年來發(fā)展起來的一種測定方式。該技術的原理是利用化學反應釋放的自由能激發(fā)中間體(常用堿性磷酸酶-金剛烷胺、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物、辣根過氧化酶-魯米諾衍生物），使其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)。當中間體從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時會釋放等能級的光子，對光子進行測定而進行定量分析。化學發(fā)光具有熒光的特異性，同時不需要激發(fā)光，避免了熒光分析中激發(fā)光雜散光的影響從而提高了靈敏度，并且避免了放射分析造成的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的定量分析方法。
化學發(fā)光免疫分析（CLIA）是一種高度敏感的微量測定技術，凡具有抗原性的物質（包括半抗原）都可以用CLIA測定。CLIA起步于80年代初，快速發(fā)展于90年代具備以下特點 ：
①高度敏感，極限達10-17－10-19mol/L，遠高于放射性免疫（RIA）、酶聯(lián)免疫（EIA）。與時間分辨熒光免疫分析(TRFIA)相當，但比TRFIA便宜。
②特異性強，重復性好CV＜10％。
③測定范圍寬，可達7個數(shù)量級。
④試劑穩(wěn)定性好，無污染有效期12月。
⑤操作簡單，易于自動化。
磁微粒化學發(fā)光免疫分析是將磁性分離技術、化學發(fā)光技術、免疫分析技術三者結合起來的一種新興分析方法。該技術充分利用了磁性分離技術的快速易自動化性，化學發(fā)光技術的高靈敏度性，以及免疫分析的特異性，在生物分析領域展現(xiàn)了不可替代的作用。
目前磁微粒化學分析免疫分析已經應用于管式化學發(fā)光免疫檢測項目以及電化學發(fā)光免疫檢測項目。
磁珠用于化學發(fā)光領域的方法：
一、間接法
間接法就是包被抗原，然后用酶標記的抗抗體檢測樣本中抗體，適合于檢測對象是自身抗體的情況。間接法的優(yōu)點：相對較方便，只要變換包被抗原就可以檢測不同的項目。間接法的缺點：標本中的特異性抗體會競爭性的結合抗原，使結果出現(xiàn)假陰性。
操作步驟：
a)磁性微球表面固定抗原。
b)加入樣本（含目標抗體）孵育，清洗。
c)加入酶標抗抗體孵育，清洗。
d)加發(fā)光底物，檢測信號。
二、捕獲法
血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定，因此測定IgM抗體多用捕獲法。先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，去除IgG后測定特異性IgM。
操作步驟：
a)將抗人IgM抗體連接在磁性固相載體上形成固相抗人IgM，洗滌。
b)加入稀釋的血清標本中的IgM抗體被固相抗體捕獲洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。
c)加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合洗滌。
d)加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合洗滌。
e)加底物顯色，檢測信號。
三、固相抗原競爭法
競爭法，是指受檢抗體和酶標抗體競爭性的與磁珠表面抗原結合。結合于固相載體的酶標抗體與受檢抗體的量呈反比。若受檢樣本中無抗體，酶標抗體能夠順利與抗原結合，出現(xiàn)強信號。若受檢樣本中有抗體，則競爭性的占去了酶標抗體與抗原的結合，酶標抗體的結合力減弱，信號強度減弱。
操作步驟：
a)磁珠表面固定特異性抗原。
b)加受檢標本和酶標抗原的混合液孵育。
c)加發(fā)光底物，檢測信號。
四、雙抗夾心（兩步法）
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法。
操作步驟：
a)將特異性抗體與磁性固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
b)加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時問，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
c)加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量成正相關。
d)加發(fā)光底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
五、雙抗夾心法（一步法）
在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hook effect），類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結果。
采用雙抗夾心法（一步法）進行化學發(fā)光檢測，當樣本中抗原量較多是，容易出現(xiàn)假陰性。
操作步驟：
a)磁珠表面固定一抗。
b)加樣本和酶標二抗孵育，清洗。
c)加發(fā)光底物，檢測信號。
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