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一、GST pull-down 基本知識

1. GST pull-down 概念

GST pull-down：是利用重組技術(shù)將探針蛋白與 GST 谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶融合，融合蛋白通過 GST 與固相化在球珠上的 GSH 谷胱甘肽結(jié)合。從而分離出能與融合蛋白相互作用的蛋白的技術(shù)。

2. GST pull-down 研究對象

二、GST pull-down 原理

1. GST pull-down 結(jié)合原理

構(gòu)建GST標簽融合表達的蛋白，然后用谷胱甘肽磁珠結(jié)合GST融合蛋白。

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2. GST pull-down 分離原理

如果是采用磁珠的話，可以采用磁分離磁珠，而無需采用離心的方法。

三、GST pull-down 流程

1. 蛋白的抽提與純化：

① 原核表達蛋白純化

② 真核表達蛋白抽提

2. 體系孵育與 pull-down

3. 考染檢測與 WB 驗證

四、GST pull-down 結(jié)果

1. GST pull-down 結(jié)果分析

① 考馬斯亮藍檢測

② Western blot 驗證

五、GST pull-down 拓展

1. GST pull-down 與 Co-IP 區(qū)別

① GST pull-down

② Co-IP

GST pull-down 與 Co-IP 區(qū)別：

GST pull-down 是原核純化蛋白與真核蛋白在試管內(nèi)發(fā)生生化反應(yīng)互作的結(jié)果，只要互作蛋白間具有相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)即可實驗證明；

Co-IP 實驗是細胞內(nèi)高表達目的蛋白，并通過 IgG 球珠-抗體-蛋白復合物體系，分離出互作的蛋白復合物，是細胞內(nèi)的體內(nèi)反應(yīng)結(jié)合。

2. GST pull-down 實驗優(yōu)點

① 可驗證蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的直接互作。

② GSH 谷胱甘肽偶聯(lián)球珠親和力強，洗脫純度高。

3. GST pull-down 實驗缺點

① 驗證互作是在試管中進行的生化反應(yīng)，不能夠完全反應(yīng)細胞內(nèi)蛋白真實互作狀態(tài)。

② 融合表達的 GST 標簽，肽鏈較長，可能會改變原目的蛋白的原有的折疊結(jié)構(gòu)。

GST蛋白pull down磁珠請參考如下網(wǎng)頁：

200nmGSH磁珠 http://m.5000js.com/Product/2897354213.html

20-45um 瓊脂糖GSH磁珠 http://m.5000js.com/Product/3249714524.html