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pull-down、免疫沉淀、免疫共沉淀、染色質(zhì)免疫共沉淀、EMSA有什么差別?

2019-4-5 13:31:57點擊:



pull-down實驗:其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白,“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。

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免疫沉淀:(immunoprecipitation)是指利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性,將抗原(常為靶蛋白)從混合體系沉淀下來,初步分離靶蛋白的一種方法。 

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免疫共沉淀(co-immunoprecipitation):是一種在體外探測兩個蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理是如果兩個蛋白在體外體系能夠發(fā)生特異性相互作用的話,那么當用一種蛋白的抗體進行免疫沉淀時,另一個蛋白也會被同時沉淀下來。

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染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation Assay, ChIP):ChIP是一項比較流行的研究轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)與啟動子(promoter)相互結(jié)合的實驗技術(shù)。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并通過超聲或酶處理將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過抗原抗體的特異性識別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。它能真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白,是目前確定與特定蛋白結(jié)合的基因組區(qū)域或確定與特定基因組區(qū)域結(jié)合的蛋白質(zhì)的一種很好的方法。 


凝膠遷移實驗(EMSA):通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫,在非變性的聚丙烯凝膠電泳上,分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同,可是雙鏈或者是單鏈。當檢測 如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白,可用純化蛋白,部分純化蛋白,或核細胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時,依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置,可用純化或部分純化的蛋白,也可用核或胞質(zhì)細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特異), 和其它非相關(guān)的片段(非特異),來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下,依據(jù)復(fù)合物的特點和強度來確定特異結(jié)合。


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